Kľúčový rozdiel – stránka SDS a Western Blot
Western blotting je technika, ktorá deteguje špecifický proteín zo vzorky proteínu. Táto technika sa vykonáva prostredníctvom niekoľkých kľúčových krokov: gélová elektroforéza, blotovanie a hybridizácia. Polyakrylamidová gélová elektroforéza s dodecylsulfátom sodným (SDS Page) je druh techniky gélovej elektroforézy, ktorá sa používa na separáciu proteínov podľa ich veľkostí (molekulových hmotností). Western blot je špeciálna vrstva blotovacej membrány, ktorá sa používa na prenos rovnakého vzoru proteínov na stránke SDS. Kľúčový rozdiel medzi SDS Page a western blot je v tom, že SDS Page umožňuje separáciu proteínov v zmesi, zatiaľ čo western blot umožňuje detekciu a kvantifikáciu špecifického proteínu zo zmesi. Obe sú užitočné pri štúdiách analýzy bielkovín.
Čo je stránka SDS?
SDS Page je technika gélovej elektroforézy používaná na separáciu proteínov. Bežne sa používa v biochémii, genetike, forenznej a molekulárnej biológii. Akonáhle sú proteíny extrahované zo vzorky, sú nanesené na gél tvorenom SDS a polyakrylamidom. SDS je aniónový detergent, ktorý sa používa na linearizáciu proteínov (denaturačné proteíny) a na udelenie negatívneho náboja linearizovaným proteínom úmerným ich molekulovej hmotnosti. Polyakrylamid sa stáva pevným nosičom gélu. Denaturované proteíny, ktoré sú negatívne nabité, migrujú smerom k kladnému koncu zariadenia cez gél. Podľa veľkosti proteínov sa rýchlosť migrácie medzi proteínmi líši a dochádza k separácii. Preto je stránka SDS užitočná na separáciu jednotlivých proteínov na základe ich veľkosti.
Príprava polyakrylamidového gélu na frakcionáciu proteínov je kľúčovým krokom na stránke SDS. Správna koncentrácia polyakrylamidu a typ použitého sieťovacieho činidla silne ovplyvňujú fyzikálne vlastnosti gélu, čo umožňuje skutočnú separáciu rôznych proteínov. Veľkosť pórov gélu by sa mala správne riadiť, aby bola separácia účinná. SDS Page sa však považuje za techniku separácie proteínov s vysokým rozlíšením.
Technika SDS Page má veľké obmedzenie pri analýze bielkovín. Keďže SDS pred separáciou denaturuje proteíny, neumožňuje detekciu enzymatickej aktivity, interakcií s väzbou proteínov, proteínových kofaktorov atď.
Obrázok 01: Strana SDS
Čo je Western Blot?
Technika Western blotting umožňuje detekciu špecifického proteínu z proteínovej zmesi a meranie množstva a molekulovej hmotnosti proteínu. Western blot je membrána používaná počas blotovacieho postupu na získanie zrkadlového obrazu proteínových vzorov v SDS-polyakrylamidovom géli. Membrána, ktorá sa používa na Western blotting, je väčšinou tvorená nitrocelulózou alebo polyvinylidéndifluoridom (PVDF). Membrána s preneseným proteínom sa môže použiť na identifikáciu požadovaného proteínu. Vyžaduje kvalitnú protilátku na detekciu požadovaného proteínu hybridizáciou. Protilátka sa naviaže na svoj špecifický antigén a odhalí prítomnosť požadovaného antigénu, ktorým je proteín.
Prenos proteínov z SDS polyakrylamidového gélu na Western blot sa vykonáva elektroblotovaním. Je to efektívna a rýchla metóda, ktorá spôsobí, že proteíny elektroforézou z gélu prejdú na nitrocelulózovú membránu (western blot).
Obrázok 02: Western Blot
Aký je rozdiel medzi SDS Page a Western Blot?
Stránka SDS vs Western Blot |
|
| SDS Page je technika gélovej elektroforézy. | Western blot je technika, ktorá sa vykonáva na membráne na detekciu špecifického proteínu zo zmesi. |
| Použiť | |
| Stránka SDS umožňuje oddelenie bielkovín podľa ich veľkosti. | Western blot umožňuje prenos proteínov na SDS page gél bez zmeny jeho vzoru a umožňuje hybridizáciu so špecifickými protilátkami. |
| Nevýhody | |
| Nevýhodami tejto techniky sú denaturácia bielkovín, vysoká cena a prítomnosť neurotoxínových chemikálií. | Táto technika je časovo náročná a vyžaduje si dobré skúsenosti s osobnými a špecifickými kontrolovanými podmienkami. |
Súhrn – stránka SDS vs Western Blot
Stránka SDS a western blot sú dve metódy zapojené do analýzy proteínov. SDS Page umožňuje jednoduchú separáciu proteínov na géli podľa ich molekulovej hmotnosti. Western blot pomáha potvrdiť prítomnosť a množstvo špecifického proteínu prostredníctvom hybridizácie so špecifickými protilátkami. Toto je rozdiel medzi SDS Page a western blot.
