Kľúčový rozdiel – stránka SDS a natívna stránka
SDS a natívna stránka sú dva typy techník elektroforézy na polyakrylamidovom géli používaných v molekulárnej biológii. Kľúčový rozdiel medzi SDS Page a Native Page je typ použitého polyakrylamidového gélu. V SDS Page sa používa denaturačný gél, preto sú molekuly separované na základe ich molekulovej hmotnosti. Naproti tomu v Native Page sa používajú nedenaturujúce gély. Preto sú molekuly oddelené na základe ich veľkosti, náboja a tvaru.
Polyakrylamidová gélová elektroforéza (Page) využíva gél vyrobený polymerizáciou akrylamidových monomérov s metylénbisakrylamidom. Polyakrylamid je tvrdší a tepelne stabilnejší ako agaróza. Polyakrylamidové gély majú menšiu veľkosť pórov, čo umožňuje účinnú separáciu proteínov. Existujú dva hlavné typy nastavení stránky, a to SDS Page a Natívna stránka. SDS Page alebo elektroforéza na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným oddeľuje proteíny na základe ich molekulových hmotností. Na stránke SDS sú použité denaturačné gély. Native Page používa nedenaturujúce gély a separuje proteíny na základe ich veľkosti, náboja a tvaru (3D konformácia).
Čo je stránka SDS?
SDS Page je najbežnejšia elektroforetická technika používaná na separáciu proteínov na základe ich molekulovej hmotnosti. Gél sa vyrába pridaním SDS (dodecylsulfát sodný), čo je detergent. SDS protézy proteínov na monoméry. SDS je aniónový detergent. Preto pridáva čistý negatívny náboj proteínom v širokom rozsahu pH. Keď sa na molekuly proteínu udelí čistý záporný náboj, v dôsledku kolísania náboja sa komplexné štruktúry rozložia. V dôsledku negatívneho náboja sa proteíny priťahujú smerom k pozitívnemu koncu. Molekuly s nižšou molekulovou hmotnosťou sa teda rýchlejšie pohybujú po gélovej matrici a možno ich pozorovať blízko anódy, zatiaľ čo proteíny s vyššou molekulovou hmotnosťou sú pozorované bližšie k jamkám.
Obrázok 01: Strana SDS
Väzba SDS na polypeptidový reťazec je úmerná jeho relatívnej molekulovej hmotnosti. Preto možno molekulovú hmotnosť určiť aj prostredníctvom stránky SDS. Farbenie gélov SDS Page sa uskutočňuje farbením brómfenolovou modrou. Aplikácie stránky SDS sa pohybujú vo väčšom rozsahu, kde sa dá použiť na odhad relatívnej molekulovej hmotnosti a na určenie relatívneho množstva proteínov v proteínovej zmesi. SDS Page možno použiť aj na určenie distribúcie proteínov v zmesi proteínov. SDS Page sa tiež používa na čistenie a hodnotenie proteínov. Používa sa ako predbežný postup pre Western blotting a hybridizáciu, ktorá sa zase používa na mapovanie a identifikáciu proteínov.
Čo je natívna stránka?
Native Polyakrylamidová gélová elektroforéza (Native Page) využíva nedenaturačný gél. Preto sa do gélovej matrice nepridáva SDS ani iné denaturačné činidlo. V Native Page je separácia proteínov založená na náboji a veľkosti proteínu. Preto mobilita proteínu závisí od náboja a veľkosti proteínu.
Náboj proteínu závisí od bočných reťazcov aminokyselín. Ak sú bočné reťazce negatívne nabité, proteín dostane celkovo negatívny náboj a naopak. Proteíny si zachovávajú 3D konformáciu vďaka skladaniu, ku ktorému dochádza. Skladanie je výsledkom niekoľkých typov väzieb v proteínoch, ako sú disulfidové väzby, hydrofóbne interakcie a vodíkové väzby. Preto, ak je natívny Page nesený pri neutrálnom pH, proteíny budú oddelené podľa molekulárneho tvaru proteínu. Preto môže byť Native Page použitá ako citlivá technika na detekciu zmeny náboja alebo konformácie proteínu.
Hlavnou výhodou natívnej stránky je, že proteín použitý na analýzu stránky môže byť po analýze stránky obnovený v pôvodnom stave, pretože proteín nie je počas procesu narušený. Native Page je technika s relatívne vysokou priepustnosťou a stabilita proteínu je zvýšená.
Obrázok 02: Natívna stránka
Po dokončení cyklu gélu je možné gél Native Page zobraziť farbením brómfenolovou modrou alebo akýmkoľvek iným vhodným farbiacim činidlom. Aplikácia Native Page zahŕňa separáciu kyslých proteínov vrátane glykoproteínov, ako je ľudský rekombinantný erytropoetín, alebo identifikáciu proteínov prítomných v bovinnom sérovom albumíne (BSA).
Aké sú podobnosti medzi stránkou SDS a natívnou stránkou?
- Systém SDS Page aj Native Page používajú polyakrylamidový gél ako matricu gélu.
- Obe sa používajú na separáciu a identifikáciu proteínov.
- Obe využívajú na oddelenie zlúčenín elektroforetickú mobilitu.
- Oboje možno vykonať vertikálne alebo horizontálne (väčšinou sa to robí ako vertikálne nastavenie stránky, pretože dĺžka cyklu je dlhšia).
- Na fungovanie oboch techník je potrebný elektroforézny prístroj vrátane nádržky na gél, hrebeňov a napájania.
- Vizualizáciu gélu je možné vykonať metódami farbenia v oboch technikách.
Aký je rozdiel medzi stránkou SDS a natívnou stránkou?
Stránka SDS verzus natívna stránka |
|
| SDS Page alebo Sodium-dodecylsulfát Page oddeľuje proteíny na základe ich molekulovej hmotnosti a používa denaturačný gél. | Native Page používa nedenaturujúce gély a oddeľuje proteíny na základe ich veľkosti, náboja a tvaru (3D konformácia). |
| Typ gélu | |
| Na stránke SDS je použitý denaturačný gél. | Na natívnej stránke je použitý nedenaturačný gél. |
| Prítomnosť SDS | |
| SDS je prítomný ako detergent, ktorý dodáva vzorke na stránke SDS záporný náboj. | SDS sa nenachádza na pôvodnej stránke. |
| Základ oddelenia | |
| Separácia proteínov závisí od molekulovej hmotnosti proteínu na stránke SDS. | Separácia závisí od veľkosti a tvaru molekuly proteínu na pôvodnej stránke. |
| Stabilita bielkovín | |
| Stabilita proteínu je na stránke SDS nízka. | Stabilita bielkovín je na natívnej stránke vysoká. |
| Obnova pôvodného proteínu | |
| Nie je možné, pretože je denaturovaný na stránke SDS. | Možnosť na pôvodnej stránke. |
Súhrn – stránka SDS verzus natívna stránka
SDS Page a Native Page sú dva typy techník elektroforézy na polyakrylamidovom géli, ktoré sa používajú na separáciu proteínov. Stránka SDS je ošetrená čistiacim prostriedkom nazývaným SDS. SDS dodáva proteínu celkový negatívny náboj, čo potom vedie k denaturácii proteínu. Preto sú proteíny oddelené na základe ich molekulovej hmotnosti. Na rozdiel od toho technika Native Page nepoužíva žiadne denaturačné činidlo. Proteíny sú teda buď oddelené na základe ich veľkosti alebo tvaru. Toto je rozdiel medzi stránkou SDS a natívnou stránkou.
