Kľúčový rozdiel – severný vs. južanský vs. západný prenos
Detekcia špecifických sekvencií DNA, RNA a proteínov je nevyhnutná pre rôzne typy štúdií v molekulárnej biológii. Gélová elektroforéza je technika, ktorá oddeľuje DNA, RNA a proteíny podľa ich veľkosti. Z gélových profilov sa deteguje konkrétna sekvencia DNA, sekvencia RNA alebo proteín pomocou špeciálnych techník nazývaných blotovanie a hybridizácia so značenými sondami. Existujú tri rôzne typy metód prenosu, a to južná, severná a západná. Kľúčový rozdiel medzi severným južným a západným prenosom spočíva v type molekuly, ktorú deteguje zo vzorky. Southern blotting je metóda, ktorá deteguje špecifickú sekvenciu DNA zo vzorky DNA. Northern blotting je technika, ktorá deteguje špecifickú sekvenciu RNA zo vzorky RNA. Western blotting je metóda, ktorá deteguje špecifický proteín zo vzorky proteínu.
Čo je Southern blotting?
Southern blotting techniku vyvinul E. M. Southern v roku 1975 na identifikáciu špecifickej sekvencie DNA zo vzorky DNA. Toto je prvá blotovacia technika zavedená v molekulárnej biológii. Umožnil detekciu špecifických génov z DNA, špecifických fragmentov z DNA atď. Technika Southern blotting zahŕňa niekoľko krokov. Sú nasledovné.
- DNA je izolovaná zo vzorky a štiepená reštrikčnými endonukleázami.
- Strávená vzorka je oddelená elektroforézou na agarózovom géli.
- Fragmenty DNA v géli sú denaturované na jednotlivé vlákna použitím alkalického roztoku.
- Jednovláknová DNA sa prenesie na nitrocelulózovú filtračnú membránu kapilárnym prenosom.
- Prenesená DNA je trvalo fixovaná na membráne.
- Fixovaná DNA na membráne je hybridizovaná so značenými sondami.
- Nenaviazaná DNA sa z membrány vymyje premytím.
- Röntgenový film sa exponuje na membránu a pripraví sa autorádiograf.
Southern blotting sa používa pre rôzne aspekty molekulárnej biológie. Je užitočný pri mapovaní RFLP, forenzných štúdiách, metylácii DNA v génovej expresii, detekcii mutovaných génov pri genetických poruchách, odtlačkoch DNA atď.
Obrázok 01: Technika Southern blotting
Čo je Northern blotting?
Northern blotting je metóda navrhnutá na detekciu špecifickej sekvencie RNA alebo sekvencie mRNA zo vzorky na štúdium génovej expresie. Túto techniku vyvinuli Alwine, Kemp a Stark v roku 1979. Od techník sourthern a western blotting sa líši niekoľkými krokmi. Táto technika sa však tiež uskutočňuje pomocou gélovej elektroforézy, blotovania a hybridizácie so špecifickými značenými sondami a detekciou. Technika Northern blotting sa vykonáva nasledovne.
- RNA sa extrahuje zo vzorky a oddelí sa gélovou elektroforézou.
- RNA sa prenesie z gélu na blotovaciu membránu a fixuje sa.
- Membrána je ošetrená značenou sondou pripravenou z cDNA alebo RNA (sonda je komplementárna k špecifickej sekvencii vo vzorke).
- Sonda sa inkubuje s membránou, aby sa naviazala so špecifickou sekvenciou.
- Nenaviazané sondy sú umyté.
- Hybridizované fragmenty deteguje autorádiograf.
Northern blotting je dôležitým nástrojom pri detekcii a kvantifikácii hybridizovanej mRNA, štúdiu degradácie RNA, hodnotení polčasu RNA, detekcii zostrihu RNA, štúdiu génovej expresie atď.
Obrázok 02: Northern blotting
Čo je Western blotting?
Western blotting je metóda detekcie špecifického proteínu z proteínovej zmesi pomocou značenej protilátky. Preto je western blot známy aj ako imunoblot. Túto techniku zaviedli Towbin et al v roku 1979 a teraz sa bežne vykonáva v laboratóriách na analýzu proteínov. Kroky sú nasledovné.
- Proteíny sú extrahované zo vzorky
- Proteíny sa oddeľujú podľa veľkosti pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli
- Oddelené molekuly sa prenášajú do PVDF membrány alebo nitrocelulózovej membrány elektroporáciou
- Membrána je blokovaná pre nešpecifickú väzbu s protilátkami
- Prenesené proteíny sú naviazané na primárnu protilátku (enzýmom označené protilátky).
- Membrána sa premyje, aby sa odstránili nešpecificky naviazané primárne protilátky
- Viazané protilátky sa detegujú pridaním substrátu a detekciou vytvoreného farebného precipitátu
Western blotting je užitočný pri detekcii protilátok proti HIV vo vzorke ľudského séra. Western blot možno použiť aj ako potvrdzujúci test na infekciu hepatitídou B a definitívny test na chorobu šialených kráv.
Obrázok 03: Western blotting
Aký je rozdiel medzi Northern Southern a Western Blot?
Severná vs. južná verzus západná blotting |
|
| Typ zistenej molekuly | |
| Northern Blotting | Northern blotting deteguje špecifickú sekvenciu RNA zo vzorky RNA. |
| Southern Blotting | Southern blotting deteguje špecifickú sekvenciu DNA zo vzorky DNA. |
| Western blotting | Western blotting deteguje špecifický proteín zo vzorky proteínu. |
| Typ gélu | |
| Northern Blotting | Toto používa agarózový/formaldehydový gél. |
| Southern Blotting | Toto používa agarózový gél. |
| Western blotting | Toto používa polyakrylamidový gél. |
| Metóda blotovania | |
| Northern Blotting | Toto je kapilárny prenos. |
| Southern Blotting | Toto je kapilárny prenos. |
| Western blotting | Toto je elektrický prevod. |
| Použité sondy | |
| Northern Blotting | sondy cDNA alebo RNA označené rádioaktívne alebo nerádioaktívne. |
| Southern Blotting | Sondy DNA sú označené rádioaktívne alebo nerádioaktívne. |
| Western blotting | Primárne protilátky sa používajú ako sondy. |
| Detekčný systém | |
| Northern Blotting | To sa vykonáva pomocou autorádiografu alebo detekcie zmeny svetla alebo farby. |
| Southern Blotting | To sa vykonáva pomocou autorádiografu, detekcie svetla alebo zmeny farby. |
| Western blotting | To sa vykonáva pomocou detekcie svetla alebo zmeny farby. |
Zhrnutie – Severná vs. južná verzus západná blotting
Blotting je špeciálna technika vyvinutá na identifikáciu špecifickej DNA, RNA alebo proteínu zo vzoriek. Na detekciu špecifického typu molekuly existujú tri samostatné postupy prenosu, a to severný, južný a západný. Technika Northern blotting je navrhnutá na detekciu špecifickej sekvencie RNA zo zmesi RNA. Technika Southern blotting umožňuje detekciu špecifickej sekvencie DNA zo vzorky DNA a technika Western blotting je vyvinutá na identifikáciu špecifického proteínu z proteínovej zmesi.
