Kľúčový rozdiel – RT PCR vs QPCR
Polymerázová reťazová reakcia je technika používaná na amplifikáciu špecifickej oblasti DNA in vitro. Vďaka vynálezu tejto techniky Karym Mullisom v roku 1983 sú vedci schopní vyrobiť tisícky až milióny kópií špecifických fragmentov DNA na výskumné účely. V súčasnosti sa stala bežnou a rutinne vykonávanou technikou v klinických a výskumných laboratóriách pre širokú škálu aplikácií. Existujú variácie tradičnej PCR techniky, ako je RT PCR, nested PCR, multiplexná PCR, Q PCR, RT – QPCR atď. RT PCR a Q PCR sú dve dôležité variácie PCR. Kľúčový rozdiel medzi RT PCR a Q PCR je v tom, že RT PCR sa používa na detekciu génovej expresie prostredníctvom vytvorenia komplementárnych transkriptov DNA (cDNA) z RNA, zatiaľ čo Q PCR sa používa na kvantitatívne meranie produktov PCR v reálnom čase pomocou fluorescenčných farbív.
Čo je RT PCR?
Reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia (RT PCR) je variant PCR, ktorý sa používa na detekciu expresie RNA. Je to veľmi dôležitá metóda na detekciu expresie mRNA v tkanivách. RT PCR sa používa, keď je východiskovým materiálom vzorky RNA. Pri RT PCR sa templátová mRNA najskôr prevedie na komplementárnu DNA. Tento krok je katalyzovaný enzýmom reverzná transkriptáza a proces je známy ako reverzná transkripcia. Po druhé, tradičná PCR sa používa pre novo syntetizovanú cDNA na amplifikáciu.
RT PCR je vysoko citlivá technika, ktorá vyžaduje relatívne malé množstvo vzorky RNA. RT PCR sa bežne používa pri diagnostike a kvantifikácii druhov RNA, najmä RNA vírusov, ako je vírus ľudskej imunodeficiencie a vírus hepatitídy C.
Obrázok 01: Technika RT PCR
Čo je QPCR?
Kvantitatívna PCR (QPCR) je variant PCR, ktorý sa používa na kvantitatívne meranie produktov PCR. Označuje sa tiež ako polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase, pretože meria amplifikáciu v reálnom čase pomocou stroja PCR v reálnom čase. Je to vhodná metóda na stanovenie množstva cieľovej sekvencie alebo génu prítomného vo vzorke. Zaujímavou vlastnosťou QPCR je, že kombinuje amplifikáciu aj skutočnú kvantifikáciu do jedného kroku. Preto môže byť potreba gélovej elektroforézy pri detekcii eliminovaná technikou QPCR. QPCR používa fluorescenčné farbivá na označenie produktov PCR počas reakcií PCR, ktoré nakoniec vedú k priamej kvantifikácii. Keď sa produkty PCR akumulujú, nahromadia sa aj fluorescenčné signály a budú merané strojom reálneho času. QPCR možno kombinovať s RT PCR. Je známa ako RT – QPCR alebo QRT – PCR a považuje sa za najvýkonnejšiu, najcitlivejšiu a kvantitatívnu metódu na detekciu hladín RNA v bunkách alebo tkanivách.
SYBR Green a Taqman sú dve metódy používané na detekciu alebo sledovanie procesu amplifikácie PCR v reálnom čase. Metóda SYBR Green sa vykonáva pomocou fluorescenčného farbiva nazývaného SYBR green a deteguje amplifikáciu naviazaním farbiva za vzniku dvojvláknovej DNA. Taqman sa vykonáva pomocou duálne značených sond a deteguje amplifikáciu degradáciou sondy Taq polymerázou a uvoľňovaním fluorofóru, ako je znázornené na obrázku 02. Obidve metódy monitorujú postup amplifikačného procesu a uvádzajú množstvo produktu v reálnom čase.
PCR v reálnom čase má širokú škálu aplikácií, ako je kvantifikácia génovej expresie, analýza mikroRNA a nekódujúcej RNA, genotypizácia SNP, detekcia variant počtu kópií, detekcia zriedkavých mutácií, detekcia geneticky modifikovaných organizmov, detekcia infekčných agens, atď.
Obrázok 02: Technika kvantitatívnej PCR
Aký je rozdiel medzi RT PCR a QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR je technika používaná na detekciu génovej expresie amplifikáciou. | QPCR je technika, ktorá amplifikuje DNA a kvantifikuje produkty PCR v reálnom čase. |
| Zapojenie enzýmu reverznej transkriptázy | |
| Na RT PCR sa používa enzýmová reverzná transkriptáza. | Enzýmová reverzná transkriptáza sa nepoužíva na QPCR. |
| Použitie fluorescenčne značených molekúl | |
| Fluorescenčne označené farbivá alebo sondy sa nepoužívajú pre RT PCR. | Na QPCR sa používajú fluorescenčne označené farbivá alebo sondy. |
| Kvantifikácia produktu PCR | |
| Pokiaľ nie je spojená s QPCR, RT PCR nekvantifikuje produkt PCR. | QPCR kvantitatívne zmerajte produkt PCR. |
| Východiskový materiál | |
| Východiskovým materiálom je mRNA. | Východiskovým materiálom je DNA. |
| Syntéza cDNA | |
| Počas RT PCR vzniká komplementárna DNA. | Doplnková DNA sa počas QPCR nevytvára. |
Zhrnutie – RT PCR vs QPCR
RT PCR a QPCR sú dve verzie tradičnej PCR. Technika RT PCR sa vykonáva pre vzorky mRNA a je riadená reverznou transkripciou a produkciou cDNA. QPCR sa používa na kvantifikáciu produktov PCR počas tepelných cyklov PCR v reálnom čase pomocou fluorescenčných farbív alebo značených sond. V QPCR je množstvo produktu PCR reprezentované emitovanými fluorescenčnými signálmi vzorky. RT PCR sa bežne používa ako amplifikačný proces, zatiaľ čo QPCR sa bežne používa ako kvantifikačný proces. Toto je rozdiel medzi RT PCR a QPCR.
