PCR vs Real-time PCR
PCR alebo Polymerázová reťazová reakcia je revolučným objavom v modernej molekulárnej biológii, ktorý prvýkrát vyvinul chemik Kary Mullis v roku 1983. Umožňuje amplifikáciu jedinej sekvencie v komplexnej DNA na analýzu. Základnou myšlienkou PCR je, že dva priméry, ktoré sú komplementárne k opačným vláknam sekvencie DNA, sú orientované k sebe; priméry vytvárajú komplementárne vlákna, z ktorých každý obsahuje druhý primér. Výsledkom je teda veľké množstvo sekvencie zodpovedajúcej DNA, ktorá leží medzi dvoma primérmi. Na predĺženie primerov v PCR sa používa enzým DNA polymeráza. DNA polymeráza je termostabilný enzým a má schopnosť prežiť pri vysokých teplotách (94 až 95 °C) používaných na denaturáciu templátovej DNA.
PCR zahŕňa tri kroky, konkrétne opakované kolá denaturácie, žíhanie primérov a syntézu DNA. Na vykonanie tejto reakcie sa používa termocykler, takže môže byť naprogramovaný tak, aby rýchlo a presne menil teploty. Aplikácie PCR sú trestné vyšetrovanie, odtlačok DNA, detekcia patogénov a analýza DNA raných ľudských druhov.
Čo je konvenčná PCR?
Existujú tri hlavné stupne konvenčnej PCR, a to; Fáza amplifikácie DNA, separácia PCR a detekcia produktov. Separácia segmentov DNA sa typicky uskutočňuje elektroforézou na agarózovom géli. Produkty sa potom farbia eteiduim bromidom. Nakoniec sa detekcia dosiahne vizualizáciou pásov na géloch pod UV svetlom. Preto konečné výsledky konvenčnej PCR nie sú vyjadrené ako čísla. Bežne je konvenčná PCR schopná detegovať iba jeden parameter.
Čo je real-time PCR?
Real-time PCR dokáže detekovať amplifikáciu produktov, pretože produkty sú syntetizované. S rozvojom technológie sa PCR stala veľmi populárnou technikou najmä na detekciu a identifikáciu baktérií v potravinách. PCR v reálnom čase využíva systém fluorescenčného farbiva a termocykler vybavený schopnosťou fluorescenčnej detekcie.
Aký je rozdiel medzi konvenčnou PCR a real-time PCR?
• Konvenčná PCR je časovo náročnejšia, pretože na analýzu amplifikovaných produktov PCR využíva gélovú elektroforézu. Na rozdiel od toho je real-time PCR menej časovo náročná, pretože dokáže detekovať amplifikácie počas skorých fáz reakcie.
• Real-time PCR zhromažďuje údaje vo fáze exponenciálneho rastu PCR, zatiaľ čo tradičná PCR zhromažďuje údaje v koncovom bode reakcie.
• Výsledky konvenčnej PCR nemusia byť veľmi presné, ale výsledky PCR v reálnom čase sú veľmi presné.
• PCR v reálnom čase je citlivejšia ako konvenčná PCR.
• Konvenčná PCR má veľmi slabé rozlíšenie, zatiaľ čo real-time PCR dokáže vďaka vysokému rozlíšeniu odhaliť len veľmi malé zmeny.
• Detekcia koncového bodu konvenčnej PCR má krátky dynamický rozsah, zatiaľ čo detekcia PCR v reálnom čase má široký dynamický rozsah.
• Na rozdiel od konvenčnej PCR sa v real-time PCR nachádzajú automatizované detekčné techniky.
• Konvenčná PCR je vysoko sofistikovaná a náročná na prácu viac ako PCR v reálnom čase.
• Na rozdiel od real-time PCR, konvenčná PCR nedokáže rozlíšiť medzi mŕtvymi a živými baktériami.
• Real-time PCR využíva fluorescenčný farbiaci systém na detekciu produktov, zatiaľ čo bežná PCR využíva etídium bromid a UV svetlo na vizualizáciu pásov v médiu agarózového gélu.
