Kľúčový rozdiel medzi konvenčnými nested a real-time PCR testami je v tom, že konvenčná PCR je technika vyvinutá na amplifikáciu špecifických sekvencií DNA a nested PCR je modifikácia konvenčnej PCR, ktorá pozostáva z dvoch sekvenčných amplifikačných reakcií, zatiaľ čo skutočná -time PCR je variant konvenčnej PCR, ktorý je schopný kvantifikovať amplifikovaný produkt.
PCR je veľmi bežná vedecká technika široko používaná vo výskume a medicíne na detekciu DNA. PCR testy sa používajú na detekciu antigénov detekciou ich DNA alebo RNA. Vo všeobecnosti je vírusová RNA prítomná v tele pred detekciou protilátok alebo zobrazením symptómov ochorenia. Test PCR môže zistiť, či niekto má alebo nemá vírus včas. V súčasnosti je štandardným testom na detekciu ochorenia COVID-19 PCR. Existujú rôzne typy techník PCR, ako je real-time PCR, nested PCR, multiplex PCR, hot start PCR a long-range PCR, atď.
Čo sú konvenčné testy PCR?
Konvenčný test PCR je technika amplifikácie DNA in vitro bežne vykonávaná v molekulárnych biologických laboratóriách. Táto metóda umožnila výrobu tisícok až miliónov kópií konkrétneho fragmentu DNA. Kary Mullis zaviedol túto techniku v roku 1980. Táto technika vyžaduje fragment DNA známy ako templát, aby bolo možné vytvoriť mnoho jeho kópií. Taq polymeráza funguje ako enzým DNA polymeráza a katalyzuje syntézu nových reťazcov templátovej sekvencie.
Priméry v zmesi PCR budú fungovať ako východiskové body pre predlžovanie fragmentov. Všetky zložky, ktoré sú potrebné na vytvorenie kópií DNA, sú zahrnuté v zmesi PCR. Reakcia PCR prebieha v stroji PCR a mala by byť napájaná správnou zmesou PCR a správnym programom PCR. Ak je reakčná zmes a program správne, vytvorí sa požadovaný počet kópií konkrétnej časti DNA z veľmi malého množstva DNA.
Obrázok 01: Konvenčný test PCR
Reakcia PCR zahŕňa tri hlavné kroky: denaturácia, hybridizácia primérov a predlžovanie reťazca. Tieto tri kroky prebiehajú pri troch rôznych teplotách. Pufer PCR udržuje optimálne podmienky pre pôsobenie Taq polymerázy. Tieto tri stupne PCR reakcie sa opakujú, aby sa vytvorilo požadované množstvo produktu PCR. Pri každej PCR reakcii sa počet kópií DNA zdvojnásobí. V PCR je teda možné pozorovať exponenciálnu amplifikáciu. Produkt PCR možno rozlíšiť pomocou gélovej elektroforézy, pretože produkuje viditeľné množstvo DNA na géli a možno ho purifikovať na ďalšie štúdie, ako je napríklad sekvenovanie.
PCR je cenným nástrojom v lekárskom a biologickom výskume. Najmä vo forenzných štúdiách má PCR obrovskú hodnotu, pretože môže amplifikovať DNA pre štúdie z malých vzoriek zločincov a vytvárať forenzné profily DNA. PCR sa široko používa v mnohých oblastiach molekulárnej biológie vrátane genotypizácie, klonovania génov, detekcie mutácií, sekvenovania DNA, mikročipov DNA a testovania otcovstva.
Čo sú vnorené PCR testy?
Nested PCR je typ PCR, ktorý znižuje nešpecifickú amplifikáciu DNA. Existujú dve po sebe nasledujúce PCR alebo dve sekvenčné amplifikačné reakcie v teste nested PCR. Počas prvej amplifikačnej reakcie sa vytvorí produkt PCR. Po prvej reakcii sa uskutoční druhá amplifikačná reakcia na produkte PCR prvej reakcie. Preto sa priméry v druhej reakčnej zmesi viažu na prvý produkt PCR a amplifikujú ho.
Obrázok 02: Nested PCR
Primérové páry sa v každej reakcii líšia. Nešpecifická väzba primérov je znížená v nested PCR. Nested PCR testy sú užitočné na zvýšenie citlivosti a/alebo špecifickosti. Nested PCR však vyžaduje znalosti o zainteresovanej sekvencii.
Čo sú testy PCR v reálnom čase?
Real-time PCR alebo kvantitatívna PCR (Q PCR) je modifikovaná verzia PCR, ktorá meria produkty PCR kvantitatívne. Preto táto technika kvantifikuje amplifikáciu v reálnom čase pomocou stroja PCR v reálnom čase. Je to tiež vhodná metóda na stanovenie množstva cieľovej sekvencie alebo génu prítomného vo vzorke.
Zaujímavou vlastnosťou real-time PCR je to, že kombinuje amplifikáciu aj skutočnú kvantifikáciu do jedného kroku. Preto môže byť potreba gélovej elektroforézy na detekciu eliminovaná technikou real-time PCR. Použitie fluorescenčných farbív na značenie produktov PCR počas reakcií PCR nakoniec povedie k priamej kvantifikácii. Keď sú produkty PCR akumulované, hromadia sa aj fluorescenčné signály a budú merané strojom v reálnom čase. SYBR Green a Taqman sú dve metódy na detekciu alebo sledovanie procesu amplifikácie PCR v reálnom čase. Obe metódy monitorujú priebeh procesu amplifikácie a hlásia množstvo produktu v reálnom čase.
Obrázok 03: Real-Time PCR
PCR v reálnom čase má širokú škálu aplikácií, ako je kvantifikácia génovej expresie, analýza mikroRNA a nekódujúcej RNA, genotypizácia SNP, detekcia variantov počtu kópií, detekcia zriedkavých mutácií, detekcia geneticky modifikovaných organizmov a detekcia infekčných agens.
Aké sú podobnosti medzi konvenčnými vnorenými a real-time PCR testami?
- Vnorené a real-time PCR testy sú modifikácie konvenčného PCR testu.
- Všetky tri techniky amplifikujú vzorky DNA.
- Ich produkty možno použiť pri sekvenovaní alebo analýze.
- Tieto analýzy vyžadujú primery.
Aký je rozdiel medzi konvenčnými vnorenými a real-time PCR testami?
Konvenčná PCR je technika vyvinutá na amplifikáciu špecifických sekvencií DNA. Medzitým je Nested PCR modifikáciou konvenčnej PCR, ktorá pozostáva z dvoch sekvenčných amplifikačných reakcií, a PCR v reálnom čase je variantom konvenčnej PCR, ktorá je schopná kvantifikovať amplifikovaný produkt. Toto je kľúčový rozdiel medzi konvenčnými vnorenými a real-time PCR testami. Na rozdiel od konvenčnej a real-time PCR, nested PCR používa dve sady primérov. Okrem toho existujú dve po sebe nasledujúce amplifikačné reakcie v nested PCR, aby sa znížila nešpecifická amplifikácia. okrem toho konvenčné a real-time PCR testy neobsahujú dve sekvenčné amplifikačné reakcie.
Nasledujúca infografika uvádza rozdiely medzi konvenčnými vnorenými a real-time PCR testami v tabuľkovej forme na porovnanie vedľa seba.
Súhrn – konvenčné verzus vnorené verzus testy PCR v reálnom čase
Konvenčná PCR je prvá technika vyvinutá na amplifikáciu špecifických fragmentov DNA. Nested PCR a real-time PCR sú dva varianty konvenčnej PCR. Existujú dve sekvenčné amplifikačné reakcie a použitie dvoch sád primérov v nested PCR. Real-time PCR je vyvinutá na kvantifikáciu amplifikovaného produktu PCR. Toto sumarizuje rozdiel medzi konvenčnými vnorenými a real-time PCR testami.
