Kľúčový rozdiel – PCR primery verzus sekvenčné primery
S nedávnym vývojom v oblasti molekulárnej biológie boli vyvinuté rôzne genetické techniky, ktoré zjednodušili a spresnili procesy skúmania rôznych spôsobov skúmania. PCR a ďalšie sekvenčné postupy sú dve dôležité také techniky. Používajú rôzne čiastkové komponenty. Priméry sa považujú za hlavnú podzložku spoločnú pre techniky PCR aj sekvenovanie. PCR priméry sa používajú na amplifikáciu konkrétnej sekvencie DNA, zatiaľ čo sekvenačné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifické poradie nukleotidovej sekvencie. Toto je kľúčový rozdiel medzi primérmi PCR a sekvenačnými primérmi.
Čo sú to PCR primery?
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je genetická technika, ktorá sa používa v oblasti molekulárnej biológie na amplifikáciu jednej alebo niekoľkých kópií určitého segmentu DNA a na získanie mnohých miliónov identických kópií. V PCR reakcii sa používajú rôzne zložky vrátane primérov. Priméry sú krátke reťazce DNA s dĺžkou nukleotidov 18-25, čo ich robí kompatibilnými so štartovacou a koncovou oblasťou DNA fragmentov, ktoré sa majú amplifikovať. Priméry môžu byť priamy primér a spätný primér. Tieto priméry sa viažu na fragment DNA v špecifických bodoch, kde sa DNA polymeráza naviaže na špecifický primér v mieste a iniciuje syntézu nového reťazca DNA.
Výber primérov je dôležitým aspektom procesu PCR. Dôležitý je výber dĺžky základného náteru. Ideálna dĺžka by mala byť 18-25 nukleotidov. Ak je dĺžka príliš krátka alebo príliš dlhá, priméry sa nenaviažu na sekvenciu DNA, ktorá sa má presne amplifikovať. Priméry, ktoré sú príliš krátke, vedú k nešpecifickému nasadaniu primérov na rôznych miestach sekvencie DNA.
Obrázok 01: PCR primery
Obsah guanínu a cytozínu (GC) v dobrom primeru by mal byť v rozmedzí 40-60. Teplota žíhania priméru a teplota topenia sú životne dôležité faktory počas PCR. Teplota topenia by sa mala vypočítať presne a teplota žíhania priméru by mala byť o 5 0C nižšia ako teplota topenia. Teplota topenia by mala byť 60 °C a 75 °C. Príliš vysoké alebo príliš nízke teploty budú mať za následok menej aktívnu aktivitu DNA polymerázy.
Čo sú sekvenčné primery?
Sekvenčné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. Na získanie dobrých výsledkov sekvenovania sú dôležité vysokokvalitné priméry a templáty. Keď sa teda vyberú priméry, mali by byť jedinečné pre konkrétnu oblasť, v ktorej chceme sekvenovať. Tiež by mala byť so správnou orientáciou tam, kde sa sekvencie zvyčajne generujú od 3' do 5' koncov primérov. Sekvencii by nemala chýbať nežiaduca samohybridizácia, ako je tvorba vlásenkových slučiek. Nemalo by obsahovať následné vytváranie guanínových báz.
Teplota topenia (Tm) primeru musí byť vhodná pre podmienky sekvenovania. Preto by mala ležať medzi 52oC a 74oC. Príprava oligonukleotidov, ktoré sa majú použiť ako primér, by mala byť purifikovaná, aby sa získala požadovaná sekvencia v plnej dĺžke. Ak oligonukleotidy obsahujú nečistoty, signalizácia sekvencie priméru bude superponovaná z rôznych miest primovania a tiež zníži počet základných buniek.
Obrázok 02: Sekvenčné primery
Teplota topenia priméru (Tm) oligonukleotidu určuje, ako silno sú komplementárne reťazce DNA navzájom hybridizované. Tm možno považovať za termodynamický výpočet, kde závisí od sekvencií DNA a niekoľkých podmienok, ako je koncentrácia soli. Tm je dôležitá počas PCR, kde sa na produkciu skupiny fragmentov zakončených dideoxynukleotidmi používa variant nazývaný sekvenovanie cyklu. Tu bude primér, ktorý je sekvenovaný, na začiatku alternatívne anelovaný, potom predĺžený a nakoniec denaturovaný na amplifikáciu. Preto by hodnota Tm mala byť medzi 52oC a 74o C. Syntetizované oligonukleotidy je možné získať z laboratórií na syntézu DNA/RNA podľa výber. Malý rozsah syntézy, ktorý sa používa na sekvenovanie DNA, je zvyčajne 50 nmol. Najdôležitejšie je, že priméry používané na sekvenovanie by mali byť čistené, aby neobsahovali nečistoty, ktoré zabránia zníženiu kvality.
Aké sú podobnosti medzi primérmi PCR a primérmi na sekvenovanie?
- Priméry PCR aj sekvenačné priméry sú priméry, ktoré sa používajú v procese amplifikácie cielenej sekvencie DNA.
- Priméry PCR aj sekvenačné priméry sú zložené z nukleotidov.
- Priméry PCR aj sekvenačné priméry sú krátke oligoméry.
Aký je rozdiel medzi primérmi PCR a primérmi na sekvenovanie?
Priméry PCR vs sekvenčné priméry |
|
| Priméry PCR sú krátke reťazce DNA s dĺžkou nukleotidovej sekvencie 18-25, vďaka čomu sú kompatibilné so štartovacou a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať. | Sekvenčné priméry sú krátke oligoméry, ktoré sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. |
| Funkcia | |
| Priméry PCR sa používajú na amplifikáciu konkrétnej sekvencie DNA. | Sekvenčné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. |
| Počet potrebných primerov | |
| Dva primery; jeden priamy primér a jeden reverzný primér sa používajú ako priméry PCR. | Potrebuje len jeden primér ako sekvenačný primér. |
Súhrn – PCR primery verzus sekvenačné primery
Sekvenčné priméry sa používajú v kontexte sekvenovania fragmentu DNA so zámerom odhaliť jeho špecifickú identitu. Na spustenie procesu bude stačiť jeden sekvenčný primer. Na získanie dobrých výsledkov sekvenovania sú dôležité vysokokvalitné priméry a templáty. Keď sa teda vyberú priméry, mali by byť jedinečné pre konkrétnu oblasť, v ktorej chceme sekvenovať. PCR primery sú krátke reťazce DNA s dĺžkou nukleotidov 18-25, ktoré sú kompatibilné so štartovacou a koncovou oblasťou fragmentov DNA, ktoré sa majú amplifikovať. PCR priméry môžu byť priamy primér a reverzný primér. Obsah guanínu a cytozínu (GC) v dobrom primeru by mal byť v rozmedzí 40-60. Teplota žíhania priméru a teplota topenia sú životne dôležité aspekty počas PCR. Toto je rozdiel medzi PCR primérmi a sekvenačnými primérmi.
