Kľúčový rozdiel medzi CRISPR a reštrikčnými enzýmami je v tom, že CRISPR je prirodzene sa vyskytujúci prokaryotický imunitný obranný mechanizmus, ktorý sa nedávno použil na úpravu a modifikáciu eukaryotických génov, zatiaľ čo reštrikčné enzýmy sú biologické nožnice, ktoré štiepia molekuly DNA na menšie látky.
Editovanie genómu a modifikácia génov sú zaujímavé a inovatívne oblasti v genetike a molekulárnej biológii. Štúdie génovej terapie široko využívajú modifikáciu génov. Okrem toho je génová modifikácia užitočná pri identifikácii vlastností génu, funkčnosti génu a toho, ako by mutácie v géne mohli ovplyvniť jeho funkciu. Je dôležité odvodiť účinné a spoľahlivé spôsoby, ako vykonať presné a cielené zmeny v genóme živých buniek. CRISPR a reštrikčné enzýmy hrajú kľúčovú úlohu v génových modifikáciách. CRISPR modifikuje gény s vysokou presnosťou. Reštrikčné enzýmy fungujú ako biologické nožnice, ktoré štiepia molekuly DNA na menšie látky.
Čo je CRISPR?
Systém CRISPR je prirodzený mechanizmus prítomný v niektorých baktériách vrátane E. coli a Archea. Ide o adaptívnu imunitnú ochranu proti cudzorodým inváziám na báze DNA. Navyše ide o sekvenčne špecifický mechanizmus. Systém CRISPR obsahuje niekoľko opakujúcich sa prvkov DNA. Tieto prvky sú rozptýlené krátkymi „spacer“sekvenciami odvodenými z cudzej DNA a viacerých génov Cas. Niektoré z génov Cas sú nukleázy. Kompletný imunitný systém sa teda označuje ako systém CRISPR/Cas.
Systém CRISPR/Cas funguje v štyroch krokoch:
- Systém geneticky uväzujúci invázne fágové a plazmidové segmenty DNA (spacery) do lokusov CRISPR (nazývaný krok získania medzerníka).
- krok maturácie crRNA – Hostiteľ prepíše a spracuje lokusy CRISPR, aby vytvoril zrelú CRISPR RNA (crRNA) obsahujúcu prvky opakovania CRISPR aj integrovaný spacer prvok.
- CrRNA deteguje homológne sekvencie DNA komplementárnym párovaním báz. Je to dôležité, keď je prítomná infekcia a infekčný agens.
- Cieľový interferenčný krok – crRNA deteguje cudziu DNA, vytvára s cudzou DNA komplex a chráni hostiteľa pred cudzou DNA.
V súčasnosti sa systém CRISPR/Cas9 používa na zmenu alebo úpravu genómu cicavcov buď represiou transkripcie alebo aktiváciou. Cicavčie bunky môžu reagovať na zlomy DNA sprostredkované CRISPR/Cas9 prijatím opravného mechanizmu. Môže sa to uskutočniť buď pomocou nehomologickej metódy spájania koncov (NHEJ) alebo homológne riadenej opravy (HDR). Oba tieto opravné mechanizmy sa uskutočňujú zavedením dvojvláknových zlomov. Výsledkom je úprava génov u cicavcov. NHEJ môže viesť k ablácii génových mutácií a môže sa použiť na vyvolanie straty funkčných účinkov. HDR možno použiť na zavedenie špecifických bodových mutácií alebo na zavedenie segmentov DNA rôznej dĺžky. V súčasnosti sa systém CRISPR/Cas využíva v oblastiach terapeutických, biomedicínskych, poľnohospodárskych a výskumných aplikácií.
Čo sú to reštrikčné enzýmy?
Reštrikčný enzým, bežnejšie označovaný ako restrikčná endonukleáza, má schopnosť štiepiť molekuly DNA na malé fragmenty. Proces štiepenia prebieha v blízkosti alebo na špeciálnom rozpoznávacom mieste molekuly DNA nazývanom reštrikčné miesto. Rozpoznávacie miesto sa typicky skladá zo 4-8 párov báz. V závislosti od miesta štiepenia môžu byť reštrikčné enzýmy štyroch (04) rôznych typov: Typ I, Typ II, Typ III a Typ IV. Okrem miesta štiepenia sa pri rozdeľovaní reštrikčných enzýmov do štyroch skupín berú do úvahy faktory ako zloženie, potreba kofaktorov a stav cieľovej sekvencie.
Počas štiepenia molekúl DNA môže byť miesto štiepenia buď na samotnom reštrikčnom mieste, alebo vo vzdialenosti od reštrikčného miesta. Reštrikčné enzýmy vytvárajú dva rezy cez každý cukor-fosfátový hlavný reťazec v dvojitej špirále DNA.
Obrázok 02: Reštrikčné enzýmy
Reštrikčné enzýmy sa nachádzajú najmä v Acháji a baktériách. Využívajú tieto enzýmy ako obranný mechanizmus proti inváznym vírusom. Reštrikčné enzýmy štiepia cudziu (patogénnu) DNA, ale nie svoju vlastnú DNA. Ich vlastná DNA je chránená enzýmom známym ako metyltransferáza, ktorý robí modifikácie v hostiteľskej DNA a zabraňuje štiepeniu.
Reštrikčný enzým typu I má miesto štiepenia, ktoré je mimo rozpoznávacieho miesta. Fungovanie enzýmu vyžaduje ATP a proteín S-adenosyl-L-metionín. Reštrikčný enzým typu I sa považuje za multifunkčný v dôsledku prítomnosti reštrikčných aj metylázových aktivít. Reštrikčné enzýmy typu II štiepia v samotnom rozpoznávacom mieste alebo v bližšej vzdialenosti od neho. Na svoju funkciu potrebuje iba horčík (Mg). Reštrikčné enzýmy typu II majú iba jednu funkciu a sú nezávislé od metylázy.
Aké sú podobnosti medzi CRISPR a reštrikčnými enzýmami?
- CRISPR a reštrikčné enzýmy sú dôležitými nástrojmi pri modifikácii génov.
- Súčasťou CRISPR alebo Cas9 a reštrikčných enzýmov sú endonukleázy.
- Obaja dokážu rozpoznať charakteristické sekvencie DNA a štiepiť DNA.
- Nachádzajú sa v baktériách a archeách.
- CRISPR aj reštrikčné enzýmy sú sekvenčne špecifické.
Aký je rozdiel medzi CRISPR a reštrikčnými enzýmami?
Systém CRISPR-Cas je prokaryotický imunitný systém, ktorý dodáva odolnosť voči cudzím genetickým prvkom. Na druhej strane sú reštrikčné enzýmy endonukleázy, ktoré rozpoznávajú špecifickú sekvenciu nukleotidov a vytvárajú dvojvláknové štiepenie v DNA. Toto je kľúčový rozdiel medzi CRISPR a reštrikčnými enzýmami.
Navyše CRISPR- umožňuje extrémne presné rezy. V porovnaní s tým je štiepenie reštrikčnými enzýmami menej presné. Okrem toho je CRISPR pokročilou technikou, zatiaľ čo reštrikčné enzýmy sú primitívne.
Infografika nižšie sumarizuje rozdiel medzi CRISPR a reštrikčnými enzýmami.
Zhrnutie – CRISPR vs. Reštrikčné enzýmy
CRISPR a reštrikčné enzýmy sú dva typy techník používaných pri modifikácii génov. CRISPR je adaptívna imunitná ochrana vykonávaná v niektorých baktériách proti inváziám na báze cudzej DNA. Je to prirodzený obranný mechanizmus. Naproti tomu reštrikčné enzýmy sú endonukleázy, ktoré štiepia dvojvláknovú DNA. CRISPR aj reštrikčné enzýmy sú schopné rozrezať DNA na malé segmenty. Obidve sú však sekvenčne špecifické. V porovnaní s CRISPR sú reštrikčné enzýmy primitívne. CRISPR umožňuje extrémne presné rezy ako reštrikčné enzýmy. Toto je zhrnutie rozdielu medzi CRISPR a reštrikčnými enzýmami.
