Kľúčový rozdiel – klonovanie génov vs PCR
Syntéza mnohých kópií DNA zo špecifického fragmentu DNA sa nazýva amplifikácia DNA. Existujú dva hlavné procesy amplifikácie DNA, a to génové klonovanie a PCR. Kľúčový rozdiel medzi génovým klonovaním a PCR je v tom, že génové klonovanie produkuje viac kópií špecifického génu in vivo konštrukciou rekombinantnej DNA a pestovaním vo vnútri hostiteľskej baktérie, zatiaľ čo PCR produkuje milióny kópií špecifického fragmentu DNA in vitro, ktoré sa podrobujú opakovaným cyklom denaturácia a syntéza.
Čo je klonovanie génov?
Klonovanie génov je technika používaná na lokalizáciu a rozmnožovanie špecifického génu z extrahovanej genómovej DNA organizmu prostredníctvom konštrukcie rekombinantnej DNA. Genomická DNA obsahuje tisíce rôznych génov kódovaných pre proteíny. Keď sa extrahuje DNA, obsahuje všetky možné gény, ktoré môže niesť. Technika klonovania génov umožnila detekciu špecifického génu z celkovej DNA. Preto génové klonovanie slúži ako dôležitý nástroj v molekulárnej biológii.
Vytvorenie genómovej knižnice organizmu je nevyhnutné pri klonovaní génov, ak neexistuje potuchy o umiestnení príslušného génu v DNA. Genomická knižnica sa vytvorí pomocou nasledujúcich krokov.
Krok 1: Extrakcia celkovej DNA z organizmu, ktorý obsahuje požadovaný gén.
Krok 2: Obmedzte štiepenie extrahovanej DNA, aby sa vytvorili malé zvládnuteľné fragmenty. Tento krok uľahčujú reštrikčné endonukleázy.
Krok 3: Výber vhodného vektora a otvorenie vektorovej DNA použitím rovnakých reštrikčných endonukleáz. Bakteriálne plazmidy sa bežne používajú ako vektory na prenášanie cudzej DNA. Plazmidy sú malé kruhy DNA nachádzajúce sa v baktériách.
Krok 4: Spojenie vektorovej DNA a fragmentovanej DNA na vytvorenie rekombinantnej molekuly DNA. Tento krok riadi DNA ligáza.
Krok 5: Prenos molekúl rekombinantnej DNA do hostiteľských baktérií. Tento krok je známy ako transformácia a vykonáva sa pomocou tepelného šoku.
Krok 5: Skríning transformovaných bakteriálnych buniek na kultivačnom médiu. Na konci transformačného procesu sa získa zmiešaná populácia transformovaných a netransformovaných hostiteľských buniek. Ako gén záujmu patrí iba v transformovaných hostiteľských bunkách. Preto je potrebné selektovať transformované bunky. Selekcia sa uskutočňuje pomocou selektívnych médií, ktoré obsahujú antibiotiká. Iba transformované bunky rastú na tomto skríningovom médiu umožňujúcom selekciu.
Krok 6: Pestovanie baktérií na vytvorenie génovej knižnice. V tomto kroku sa transformované hostiteľské bunky zavedú do čerstvého kultivačného média, ktoré poskytuje optimálne rastové požiadavky. Celkové kolónie na kultivačných platniach predstavujú genómovú knižnicu tohto organizmu.
Krok 7: Molekula rekombinantnej DNA obsahujúca požadovaný gén sa musí skrínovať z tisícov klonovaných fragmentov rekombinantnej DNA. Dá sa to dosiahnuť použitím sond, ktoré označujú špecifický gén alebo špecifický proteín pochádzajúci z tohto génu.
Akonáhle je zainteresovaný gén obsahujúci bakteriálnu kolóniu identifikovaný z celkových kolónií, je možné vytvoriť milióny kópií rekombinantného plazmidu, ktorý obsahuje gén.
Klonovanie génov sa používa pri zakladaní génových knižníc, produkcii špeciálnych proteínov, vitamínov, antibiotík, hormónov, sekvenovaní a mapovaní genómov organizmov, vytváraní viacerých kópií DNA jednotlivcov vo forenznej analýze atď.
Obrázok_1: Klonovanie génov
Čo je to PCR?
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je technika, ktorá generuje veľké množstvo kópií konkrétneho fragmentu DNA. Exponenciálna amplifikácia špecifickej sekvencie DNA sa získa pomocou PCR v podmienkach in vitro. Táto technika je veľmi silným nástrojom v molekulárnej biológii, pretože dokáže rozmnožiť malú vzorku DNA na použiteľné množstvo. PCR zaviedol Kary Mullis v roku 1983 a tento oceňovaný vynález vytvoril obrovský pokrok v molekulárnej biológii.
PCR technika sleduje opakované PCR reakcie, ako je znázornené na obrázku 02. Jedna PCR reakcia pozostáva z troch hlavných krokov prebiehajúcich pri troch rôznych teplotách; denaturácia dvojvláknovej DNA pri 94 0C, žíhanie primérov pri 68 0C a predĺženie vlákna pri 72 0 C. Preto, keď sa vykonáva PCR, kolísanie teploty by malo byť vysoko udržiavané pre správnu replikáciu. PCR sa vykonáva v zariadení PCR vo vnútri skúmaviek PCR. PCR skúmavky sú naplnené správnymi PCR zmesami obsahujúcimi templátovú DNA, Taq polymerázu, priméry, dNTP a pufor. Denaturácia dvojvláknovej vzorky DNA na jednovláknovú DNA sa vykonáva prerušením vodíkových väzieb medzi komplementárnymi bázami pri 94 – 98 0C. Potom sú jednotlivé vlákna templátovej DNA vystavené pre priméry. Mal by byť poskytnutý pár základných náterov (vpred a vzad), ktoré by mali byť termostabilné, aby tolerovali vysoké teploty. Priméry sú jednovláknové krátke DNA sekvencie komplementárne ku koncom cieľového fragmentu DNA. V PCR sa používajú syntetické priméry. Priméry sa viažu na komplementárne bázy vzorky DNA a iniciujú syntézu nového vlákna. Tento krok je katalyzovaný enzýmom nazývaným Taq polymeráza; termostabilný enzým DNA polymeráza izolovaný z Thermus auqaticus. Keď sú dostupné priméry a nukleotidy (stavebné bloky), Taq polymeráza vytvorí nový reťazec DNA komplementárny k templátovej DNA. Na konci programu PCR sa pomocou gélovej elektroforézy pozoruje amplifikovaný fragment DNA. Ak je potrebná ďalšia analýza, produkt PCR sa purifikuje z gélu.
PCR je veľmi užitočná pri diagnostike a monitorovaní genetických a získaných chorôb, identifikácii zločincov (v oblasti kriminalistiky), štúdiu štruktúry a funkcie cieleného segmentu DNA, sekvenovaní a mapovaní genómov organizmov, atď. PCR sa medzi vedcami stala rutinnou laboratórnou technikou vo výskumných laboratóriách medicíny a molekulárnej biológie, pretože má širokú škálu aplikácií.
Obrázok_2: Polymerázová reťazová reakcia
Aký je rozdiel medzi klonovaním génov a PCR?
Klonovanie génov vs PCR |
|
| Klonovanie génov je proces vytvárania viacerých kópií špecifického génu in vivo prostredníctvom rekombinantnej DNA a transformácie na hostiteľskú baktériu. | Technika PCR vytvára viacero kópií konkrétnej sekvencie DNA in vitro prostredníctvom opakovaných cyklov reakcií PCR. |
| Požiadavka na konštrukciu rekombinantnej DNA | |
| Rekombinantná DNA sa vyrába za účelom lokalizácie génu. | Rekombinantná DNA sa nevyrába. |
| Potreba práce | |
| Tento proces je náročný na prácu. | Intenzívna práca nie je potrebná. |
| Proces in vivo alebo in vitro | |
| Konštrukcia rekombinantnej DNA je in vitro a amplifikácia DNA je in vivo. | Amplifikácia DNA prebieha úplne in vitro. |
Zhrnutie – Klonovanie génov vs PCR
Klonovanie génov a PCR sú dve metódy používané na amplifikáciu DNA. PCR je proces in vitro, ktorý vytvára viac kópií DNA určitého fragmentu DNA bez použitia rekombinantnej DNA a hostiteľského organizmu. Génové klonovanie je primárne proces in vivo, ktorý vedie k viacnásobným kópiám zainteresovaného génu vo vnútri hostiteľského organizmu prostredníctvom konštrukcie rekombinantnej DNA. Toto je rozdiel medzi klonovaním génov a PCR.
