Kľúčový rozdiel – nitrocelulóza vs PVDF
Western blotting je metóda, ktorá umožňuje detekciu a kvantifikáciu špecifických proteínov z proteínovej vzorky. Spoľahlivosť techniky závisí od výberu správnej membrány pre absorpciu proteínov z gélu. Existujú rôzne typy mikroporéznych membrán. Nitrocelulózové a PVDF membrány sú dve takéto membrány, ktoré výskumníci uprednostňujú kvôli ich špeciálnym vlastnostiam oproti iným typom membrán. Výber medzi nitrocelulózou alebo PVDF je tiež ďalšou výzvou pri westernovom prenose. Nitrocelulóza aj PVDF majú vysokú absorpčnú kapacitu proteínov. Kľúčový rozdiel medzi nitrocelulózovou a PVDF membránou je v tom, že nitrocelulózové membrány nemajú schopnosť odstrániť protilátky a opätovne použiť membránu na opätovné testovanie protilátok, zatiaľ čo PVDF membrány majú schopnosť stripovania a opätovného použitia.
Čo je nitrocelulóza?
Nitrocelulóza je polymér vyrobený spracovaním celulózy kyselinou dusičnou a používa sa na výrobu mikroporéznych membrán v molekulárnej biológii, najmä pre techniky prenosu, ako je Southern, Northern a Western blot. Veľkosť pórov nitrocelulózových membrán sa pohybuje od 3 do 20 um. Nitrocelulózové mikroporézne membrány uľahčujú detekciu imunochemickej reakcie prebiehajúcej na povrchu membrány. Preto sa nitrocelulózové membrány často používajú na imobilizáciu proteínov a detekciu špecifických proteínov pri westernovom prenose. Nitrocelulózové membrány môžu tiež imobilizovať glykoproteíny a nukleové kyseliny.
Nitrocelulózové membrány sú preferované v testoch s laterálnym prietokom kvôli niekoľkým vlastnostiam. Nitrocelulózové membrány absorbujú proteíny vo vysokej koncentrácii. Rozpúšťadlo použité na zvlhčenie membrány neznižuje absorpciu proteínu nitrocelulózovej membrány. Nitrocelulózové membrány možno ľahko narezať na požadovanú veľkosť gélu a preniesť proteíny z gélu na membránu elektrickým alebo kapilárnym prenosom. Nitrocelulóza umožňuje rýchlejší tok bielkovín cez membránu s vysokým väzbovým potenciálom. Nitrocelulóza vykazuje zlepšenú pevnosť pri manipulácii. Ďalšou špeciálnou vlastnosťou nitrocelulózovej membrány je, že sa dá ľahko nalepiť nerozpúšťadlovými vode odolnými lepidlami na rôzne plastové podklady.
Obrázok 01: Nitrocelulózová membrána pre Western blotting
Čo je PVDF?
Polyvinylidéndifluorid (PVDF) je fluórpolymér vyrobený polymerizáciou vinylidéndifluoridu a má vysokú schopnosť imobilizácie proteínov. Preto sa mikroporézne membrány vyrobené z PVDF používajú v technikách western blotting na analýzu špecifických proteínov zo zmesí proteínov. PVDF membrány možno použiť aj na analýzu aminokyselín a sekvenovanie proteínov. Najdôležitejšou charakteristikou PVDF membrány nad nitrocelulózovou membránou je, že sa dá ľahko odstrániť z protilátok a znovu použiť pre následné protilátkové sondy.
PVDF membrány sú hrubšie ako nitrocelulózové membrány; preto sú odolnejšie voči poškodeniu pri opätovnom použití. PVDF membrány sú vysoko hydrofóbne. Preto musia byť pred použitím namočené v metanole alebo izopropanole.
Aký je rozdiel medzi nitrocelulózou a PVDF?
Nitrocelulóza vs PVDF |
|
| Nitrocelulóza je polymér zložený z celulózy. | PVDF je fluórpolymér vyrobený polymerizáciou vinylidéndifluoridu. |
| Veľkosť pórov membrány | |
| Typické veľkosti pórov sú 0,1, 0,2 alebo 0,45μ | Typické veľkosti pórov sú 0,1, 0,2 alebo 0,45 μm |
| Kapacita viazania bielkovín | |
| Nitrocelulóza má schopnosť viazať proteíny 80 až 100 μg/cm2. | PVDF má schopnosť viazať proteíny 170 až 200 μg/cm2. |
| Citlivosť | |
| Toto má nízku citlivosť v porovnaní s PVDF. | Toto má vysokú citlivosť. |
| Detekcia nízko exprimovaných bielkovín | |
| Keďže citlivosť nitrocelulózových membrán je nízka, nie je vhodná na detekciu proteínov s nízkou expresiou. | Toto je vhodnejšie na detekciu proteínov s nízkou expresiou vďaka svojej vysokej citlivosti. |
| Hluk na pozadí | |
| Toto má nižší hluk na pozadí | Toto má vyšší hluk na pozadí. |
| Interakcie s proteínmi | |
| Proteínové molekuly sa viažu na nitrocelulózové membrány prostredníctvom hydrofóbnych interakcií. | Proteíny sa viažu na PVDF membrány prostredníctvom hydrofóbnych a dipólových interakcií. |
| Povaha membrány | |
| Nitrocelulóza je krehká a krehká. Dostupné sú však verzie nitrocelulózy, ktoré sú odolné. | PVDF je odolnejší a má vyššiu chemickú odolnosť. |
| Schopnosť vyzliecť a znova použiť | |
| Nitrocelulóza môže mať ťažkosti pri odstraňovaní a odstraňovaní sondy bez straty signálu. | PVDF je ideálny na opakované testovanie a sekvenovanie aplikácií. |
| Vhodnosť | |
| Nitrocelulóza je ideálna na detekciu proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou. | PVDF je vhodnejší na detekciu proteínov s vyššou molekulovou hmotnosťou. |
| Iné použitia | |
| Nitrocelulóza sa môže použiť na analýzu nukleových kyselín a dot/slot blotting. | PVDF možno použiť na sekvenovanie proteínov a testovacie systémy na pevnej fáze. |
| Cost | |
| Je to lacnejšie ako membrány PVDF. | Je to drahšie ako nitrocelulózové membrány. |
| Potreba predbežného zvlhčovania | |
| Nitrocelulózové membrány nevyžadujú namáčanie metanolom | PVDF membrány vyžadujú predbežné namočenie metanolom. |
Zhrnutie – Nitrocelulóza vs PVDF
Nitrocelulózové membrány boli prvé komerčne používané membrány na test laterálneho toku. Majú vysokú schopnosť absorbovať bielkoviny. Preto sa pri westernovom prenose používajú nitrocelulózové membrány. PVDF je ďalší typ membrány používaný pri westernovom prenose a má tiež vysokú absorpčnú kapacitu proteínov. Oba typy sa používajú vo westernovom prenose na analýzu proteínov. PVDF membrány však majú viac špeciálnych vlastností, vďaka čomu sú vhodnejšie ako nitrocelulózové membrány pre western blotting. Ale nitrocelulózové membrány sú vhodnejšie na detekciu proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou, membrány PVDF sú vhodnejšie na detekciu proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou. Toto je rozdiel medzi nitrocelulózovými a PVDF membránami.
