Kľúčový rozdiel medzi sekvenovaním pomocou brokovnice a sekvenovaním ďalšej generácie je v tom, že sekvenovanie pomocou brokovnice je metóda sekvenovania, ktorá náhodne rozdeľuje sekvencie DNA na mnoho malých fragmentov a znova zostavuje sekvenciu pozorovaním prekrývajúcich sa oblastí pri sekvenovaní ďalšej generácie (NGS) je pokročilá metóda genetického sekvenovania, ktorá závisí od kapilárnej elektroforézy.
Sekvenovanie je proces, ktorý určuje presné poradie nukleotidov v géne, zhluku génov, chromozóme a kompletnom genóme. V genomických štúdiách, forenzných štúdiách, virológii, biologickej systematike, lekárskej diagnostike, biotechnológii a v mnohých iných oblastiach je veľmi dôležité analyzovať štruktúru a funkciu génov a identifikáciu organizmov. Okrem toho sú k dispozícii rôzne typy sekvenčných metód. Brokovnicové sekvenovanie a sekvenovanie novej generácie sú dve pokročilé metódy.
Čo je sekvenovanie brokovníc?
Shotgun sekvenovanie je metóda sekvenovania, ktorá náhodne rozdeľuje sekvencie DNA celého chromozómu alebo celého genómu na mnoho malých fragmentov a znova ich zostavuje počítačmi prostredníctvom pozorovania prekrývajúcich sa sekvencií alebo oblastí. Vo všeobecnosti sú genómy cicavcov štrukturálne zložité a majú väčšiu veľkosť. Preto je ťažké ich sekvenovať klonovaním, pretože je to časovo náročné. Sekvenovanie brokovníc je rýchlejšia metóda. Realizácia je tiež lacnejšia. Preto sa moderní vedci pri riešení zložitých genómov spoliehajú na metódu sekvenovania brokovnicou.
Obrázok 01: Sekvencia brokovnice
Sekvenčný postup brokovnice je pomerne jednoduchý. Začína sa fragmentáciou celého genómu na rôzne veľkosti od 20-kilových báz po 300-kilové bázy. Potom by mal byť každý fragment sekvenovaný pomocou metódy ukončenia reťazca. Po sekvenovaní je potrebné poskladať fragmenty pohľadom na prekrývajúce sa oblasti pomocou sofistikovaného počítačového softvéru. Pre túto metódu nie je potrebné konvenčné mapovanie a klonovanie sekvencií. Okrem toho sa v tejto metóde nepoužíva genetická mapa. Keďže sa však nepoužívajú existujúce mapy genómu, je pravdepodobnejšie, že sa počas zostavovania vyskytnú chyby. Je to jedna z hlavných nevýhod tejto metódy. Okrem toho kratšie fragmenty poskytujú menej jedinečné informácie pre každé čítanie v tejto metóde. Okrem toho sekvenovanie brokovníc neposkytuje dostatok údajov na určenie konsenzuálnej sekvencie s požadovaným štandardom presnosti.
Napriek vyššie uvedeným nedostatkom je metóda sekvenovania brokovnicou v súčasnosti najefektívnejšou a cenovo najefektívnejšou stratégiou na sekvenovanie mikrobiálnych genómov vrátane baktérií, vírusov a kvasiniek. Je to preto, že v ich genómoch chýbajú opakujúce sa oblasti, ktoré sa ťažko sekvenujú, a tieto genómy je možné ľahko zostaviť do chromozómov bez chýb.
Čo je sekvenovanie novej generácie?
Next Generation Sequencing (NGS) je termín používaný na označenie moderných vysokovýkonných sekvenčných procesov. Opisuje množstvo rôznych moderných sekvenčných technológií, ktoré spôsobili revolúciu v genómových štúdiách a molekulárnej biológii. Medzi tieto techniky patrí sekvenovanie Illumina, sekvenovanie Roche 454, sekvenovanie iónových protónov a sekvenovanie SOLiD (sekvenovanie pomocou detekcie ligácie oligo). Systémy NGS sú rýchlejšie a lacnejšie. V systémoch NGS sa používajú štyri hlavné metódy sekvenovania DNA: pyrosekvenovanie, sekvenovanie syntézou, sekvenovanie ligáciou a sekvenovanie iónových polovodičov. NGS môže paralelne sekvenovať veľké množstvo reťazcov DNA alebo RNA (milióny). Umožňuje sekvenovanie celého genómu organizmov v krátkom časovom období.
Obrázok 02: Sekvenovanie novej generácie
NGS má rôzne výhody. Je to vysokorýchlostný, presnejší a nákladovo efektívnejší proces, ktorý možno vykonať s malou veľkosťou vzorky. Umožňuje teda analýzu celého ľudského genómu v jedinom sekvenčnom experimente. Okrem toho sa NGS môže použiť v metagenomických štúdiách, pri detekcii variácií v rámci individuálneho genómu v dôsledku inzercií a delécií atď., a pri analýze génových expresií. Okrem toho môže NGS analyzovať celé transkriptómy z veľkého počtu tkanív súčasne. Preto NGS spôsobila revolúciu v analýze transkriptómov.
Aké sú podobnosti medzi sekvenovaním brokovnice a sekvenovaním novej generácie?
- Sekvenovanie brokovnicou a sekvenovanie novej generácie sú dve metódy sekvenovania genómu.
- Obe metódy sú rýchle metódy.
- Navyše sú to nákladovo efektívne metódy.
- Sú schopné paralelne sekvenovať mnoho fragmentov DNA.
Aký je rozdiel medzi sekvenovaním brokovnice a sekvenovaním novej generácie?
Sekvenovanie brokovnicou a sekvenovanie novej generácie sú dve pokročilé techniky sekvenovania. Metóda sekvenovania pomocou brokovnice náhodne rozbije sekvencie DNA celého chromozómu alebo celého genómu na mnoho malých fragmentov a pomocou počítačov tieto sekvencie znova poskladá pozorovaním prekrývajúcich sa sekvencií alebo oblastí. Naproti tomu Next Generation Sequencing (NGS) je termín, ktorý označuje moderné vysokovýkonné sekvenčné procesy. Toto je kľúčový rozdiel medzi sekvenovaním brokovnice a sekvenovaním ďalšej generácie. Okrem toho sekvenovanie ďalšej generácie je technika, ktorá závisí od kapilárnej elektroforézy, zatiaľ čo sekvenovanie pomocou brokovnice nezávisí. Preto je to tiež rozdiel medzi sekvenovaním brokovnice a sekvenovaním ďalšej generácie. Navyše, v porovnaní s brokovnicovým sekvenovaním je sekvenovanie novej generácie vysoko citlivé a vysoko presné.
Zhrnutie – Sekvenovanie brokovnice vs sekvenovanie novej generácie
Sekvenovanie brokovnicou a sekvenovanie novej generácie sú dve sekvenačné metódy používané pri sekvenovaní genómu. Obe metódy sú rýchle a nákladovo efektívne metódy. NGS funguje na princípe sekvenovania miliónov sekvencií súčasne rýchlym spôsobom prostredníctvom sekvenčného systému. Na rozdiel od toho sekvenovanie brokovníc vyžaduje rozbitie genómov na malé fragmenty a sekvenovanie a opätovné zostavenie pomocou prekrývajúcich sa sekvencií. Toto sumarizuje rozdiel medzi sekvenovaním brokovnice a sekvenovaním ďalšej generácie.
