Kľúčový rozdiel – Microarray vs RNA sekvenovanie
Transcriptóm predstavuje celý obsah RNA prítomnej v bunke vrátane mRNA, rRNA, tRNA, degradovanej RNA a nedegradovanej RNA. Profilovanie transkriptómu je dôležitý proces na pochopenie bunkového prehľadu. Existuje niekoľko pokročilých metód na profilovanie transkriptómu. Microarray a RNA sekvenovanie sú dva typy technológií vyvinutých na analýzu transkriptómu. Kľúčový rozdiel medzi microarray a RNA sekvenovaním je v tom, že microarray je založený na hybridizačnom potenciáli vopred navrhnutých značených sond s cieľovými cDNA sekvenciami, zatiaľ čo RNA sekvenovanie je založené na priamom sekvenovaní cDNA reťazcov pomocou pokročilých sekvenčných techník, ako je NGS. Microarray sa vykonáva s predchádzajúcimi znalosťami o sekvenciách a sekvenovanie RNA sa vykonáva bez predchádzajúcich znalostí o sekvenciách.
Čo je Microarray?
Microarray je robustná, spoľahlivá a vysoko výkonná metóda, ktorú vedci používajú na profilovanie prepisov. Je to najpopulárnejší prístup na analýzu transkriptov. Je to nízkonákladová metóda, ktorá závisí od hybridizačných sond.
Technika začína extrakciou mRNA zo vzorky a konštrukciou cDNA knižnice z celkovej RNA. Potom sa zmieša s fluorescenčne označenými vopred navrhnutými sondami na pevnom povrchu (bodová matrica). Komplementárne sekvencie hybridizujú so značenými sondami v mikročipe. Potom sa microarray premyje a preosieva a obraz sa kvantifikuje. Zhromaždené údaje by sa mali analyzovať, aby sa získali relatívne profily výrazov.
Predpokladá sa, že intenzita mikročipových sond je úmerná množstvu transkriptov vo vzorke. Presnosť techniky však závisí od navrhnutých sond, predchádzajúcej znalosti sekvencie a afinity sond pre hybridizáciu. Technológia microarray má preto obmedzenia. Technika microarray sa nedá vykonať s nízkym výskytom transkriptov. Nedokáže rozlíšiť izoformy a identifikovať genetické varianty. Keďže táto metóda závisí od hybridizácie sond, pri technike microarray sa vyskytujú určité problémy súvisiace s hybridizáciou, ako je krížová hybridizácia, nešpecifická hybridizácia atď.
Obrázok 01: Microarray
Čo je sekvenovanie RNA?
Sekvenovanie RNA brokovnicou (RNA seq) je nedávno vyvinutá technika sekvenovania celého transkriptómu. Je to rýchla a vysoko výkonná metóda profilovania transkriptómu. Priamo kvantifikuje expresiu génov a vedie k hlbokému skúmaniu transkriptómu. RNA seq nezávisí od vopred navrhnutých sond alebo predchádzajúcej znalosti sekvencií. Preto má metóda RNA seq vysokú citlivosť a schopnosť detegovať nové gény a genetické varianty.
Sekvenčná metóda RNA sa vykonáva v niekoľkých krokoch. Celková RNA bunky sa musí izolovať a fragmentovať. Potom sa pomocou reverznej transkriptázy musí pripraviť knižnica cDNA. Každý cDNA reťazec musí byť ligovaný s adaptérmi. Potom musia byť ligované fragmenty amplifikované a purifikované. Nakoniec pomocou metódy NGS sa musí vykonať sekvenovanie cDNA.
Obrázok 02: Sekvenovanie RNA
Aký je rozdiel medzi sekvenovaním Microarray a RNA?
Microarray vs sekvenovanie RNA |
|
| Microarray je robustná, spoľahlivá a vysoko výkonná metóda. | Sekvenovanie RNA je presná a vysoko výkonná metóda. |
| Cost | |
| Toto je nízkonákladová metóda. | Toto je drahý spôsob. |
| Analýza veľkého počtu vzoriek | |
| To uľahčuje analýzu veľkého počtu vzoriek súčasne. | Uľahčuje to analýzu veľkého počtu vzoriek. |
| Analýza údajov | |
| Analýza údajov je zložitá. | Touto metódou sa generuje viac údajov; preto je tento proces zložitejší. |
| Predchádzajúca znalosť sekvencií | |
| Táto metóda je založená na hybridizačných sondách, takže sú potrebné predchádzajúce znalosti sekvencií. | Táto metóda nezávisí od predchádzajúcej znalosti sekvencie. |
| Štrukturálne variácie a nové gény | |
| Táto metóda nedokáže odhaliť štrukturálne variácie a nové gény. | Táto metóda dokáže odhaliť štrukturálne variácie, ako je fúzia génov, alternatívne zostrihy a nové gény. |
| Citlivosť | |
| Toto nedokáže zistiť rozdiely v expresii izoforiem, takže to má obmedzenú citlivosť. | Toto má vysokú citlivosť. |
| Výsledok | |
| Výsledkom môžu byť iba relatívne úrovne vyjadrenia. Toto neposkytuje absolútnu kvantifikáciu génovej expresie. | Poskytuje absolútne a relatívne úrovne vyjadrenia. |
| Reanalýza údajov | |
| Toto je potrebné zopakovať, aby bolo možné znova analyzovať. | Sekvenčné údaje možno znova analyzovať. |
| Potreba konkrétneho personálu a infraštruktúry | |
| Pre microarray nie je potrebná špecifická infraštruktúra a personál. | Špecifická infraštruktúra a personál vyžadovaný sekvenovaním RNA. |
| Technické problémy | |
| Technika Microarray má technické problémy, ako je krížová hybridizácia, nešpecifická hybridizácia, obmedzená rýchlosť detekcie jednotlivých sond atď. | Technika RNA seq zabraňuje technickým problémom, ako je krížová hybridizácia, nešpecifická hybridizácia, obmedzená rýchlosť detekcie jednotlivých sond atď. |
| Predsudky | |
| Toto je neobjektívna metóda, pretože závisí od hybridizácie. | Odklon je nízky v porovnaní s microarray. |
Súhrn – Microarray vs RNA sekvenovanie
Metódy Microarray a sekvenovania RNA sú vysoko výkonné platformy vyvinuté na profilovanie transkriptómov. Obe metódy poskytujú výsledky, ktoré vysoko korelujú s profilmi génovej expresie. Sekvenovanie RNA má však výhody oproti microarray pre analýzu génovej expresie. Sekvenovanie RNA je citlivejšia metóda na detekciu transkriptov s nízkym výskytom ako microarray. Sekvenovanie RNA tiež umožňuje diferenciáciu medzi izoformami a identifikáciu génových variantov. Microarray je však bežnou voľbou väčšiny výskumníkov, pretože sekvenovanie RNA je nová a nákladná technika s výzvami na ukladanie údajov a komplexnú analýzu údajov.
