Kľúčový rozdiel – RAPD vs RFLP
Genetické markery sa používajú v molekulárnej biológii na identifikáciu genetických variácií medzi jednotlivcami a druhmi. Náhodne amplifikovaná polymorfná DNA (RAPD) a polymorfizmus dĺžky reštrikčného fragmentu (RFLP) sú dva dôležité molekulárne markery bežne používané v laboratóriách. RAPD sa uskutočňuje s krátkymi a ľubovoľnými oligonukleotidovými primérmi a je založená na náhodnej amplifikácii viacerých miest v templátovej DNA organizmu. RFLP sa uskutočňuje so špecifickou reštrikčnou endonukleázou a je založená na polymorfizme výsledných reštrikčných fragmentov a hybridizácii. Kľúčový rozdiel medzi RAPL a RFLP je v tom, že RAPD je typ techniky PCR vykonávanej bez predchádzajúcej znalosti sekvencie, zatiaľ čo RFLP nie je zapojený do PCR a vyžaduje predchádzajúce znalosti sekvencie na vykonanie techniky.
Čo je RAPD?
RAPD je užitočný molekulárny marker v molekulárnej biológii. Je to rýchla a jednoduchá technika. RAPD možno definovať ako metódu, ktorej výsledkom sú polymorfné sekvencie DNA ako výsledok náhodnej amplifikácie viacerých miest cieľového templátu DNA. RAPD používa krátke oligonukleotidové priméry s ľubovoľnými sekvenciami na PCR amplifikáciu. Priméry sú umelo syntetizované bez predchádzajúcej znalosti sekvencie. Preto sa považuje za jednoduchú a užitočnú techniku.
V RAPD sú zahrnuté nasledujúce hlavné kroky.
- Extrakcia cieľovej DNA
- Amplifikácia viacerých umiestnení cieľovej DNA pomocou náhodne vybraných primerov
- Gélová elektroforéza amplifikovaných produktov PCR
- Zafarbenie etídiumbromidom a identifikácia polymorfizmu
V dôsledku variácií v anelácii primérov sa počas amplifikácie generujú rôzne fragmenty s rôznymi dĺžkami. Vzory pásov na géloch sa preto medzi jednotlivcami a druhmi líšia. RAPD teda umožňuje detekciu genetických variácií medzi organizmami pri identifikácii a diferenciácii.
RAPD sa používa v rôznych štúdiách molekulárnej biológie, ako je identifikácia genetických rozdielov medzi blízko príbuznými druhmi, mapovanie génov, odtlačky prstov DNA, identifikácia dedičných chorôb atď.
Obrázok 01: RAPD
Čo je RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) je molekulárny marker používaný v molekulárnej biológii na identifikáciu genetických variácií v homológnych sekvenciách DNA. Je to prvý genetický marker vyvinutý pre DNA fingerprinting. Všetky organizmy vytvárajú jedinečné profily DNA, keď sú obmedzené špecifickými reštrikčnými enzýmami. RFLP slúži ako dôležitý nástroj pri vytváraní jedinečných profilov DNA jednotlivcov a detekcii genetických variácií medzi nimi. Keď sa vzorky DNA štiepia špecifickými reštrikčnými endonukleázami, získajú sa rôzne profily DNA, ktoré sú jedinečné pre každého jednotlivca. Preto je princípom tejto metódy detekcia genetických variácií medzi organizmami reštrikciou homológnej DNA špecifickými reštrikčnými enzýmami a analýza polymorfizmu dĺžky fragmentov pomocou gélovej elektroforézy a blotovania. Vzory blotovania sú jedinečné pre každý organizmus a charakterizujú špecifické genotypy.
S RFLP sú zahrnuté nasledujúce kroky.
- Izolácia dostatočného množstva DNA zo vzoriek
- Fragmentácia vzoriek DNA so špecifickými restrikčnými endonukleázami do krátkej sekvencie
- Separácia výsledných fragmentov s rôznymi dĺžkami elektroforézou na agarózovom géli.
- Prenos gélového profilu do membrány metódou Southern blotting
- Hybridizácia membrány so značenými sondami a analýza polymorfizmu dĺžky fragmentov v každom profile
RFLP má rôzne aplikácie, ako je diagnostika dedičných chorôb, mapovanie genómu, kriminalistická identifikácia vo forenzných štúdiách, testovanie otcovstva atď.
Obrázok 02: RFLP genotypizácia
Aký je rozdiel medzi RAPD a RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD je molekulárny marker založený na náhodných primeroch a PCR. | RFLP je molekulárny marker založený na produkcii rôznych dĺžkových reštrikčných fragmentov. |
| Požadovaná vzorka | |
| Na RAPD analýzu stačia malé vzorky DNA. | Na analýzu RFLP je potrebné veľké množstvo extrahovanej vzorky DNA. |
| Čas | |
| RAPD je rýchly proces. | RFLP je časovo náročný proces. |
| Použitie základného náteru | |
| Používajú sa náhodné priméry a rovnaké priméry možno použiť pre rôzne druhy. | Druhovo špecifické sondy sa v RFLP používajú na hybridizáciu. |
| Spoľahlivosť | |
| Spoľahlivosť techniky je menšia v porovnaní s RFLP. | RFLP je spoľahlivá technika. |
| Blotting | |
| RAPD zahŕňa Southern blotting. | Southern blotting je jedným krokom RFLP. |
| Detekcia alelickej variácie | |
| Alelické variácie nie je možné zistiť pomocou RAPD. | Alelické variácie možno zistiť pomocou RFLP. |
| Need for Sequence Knowledge | |
| RAPD nevyžaduje predchádzajúce znalosti sekvencie. | Na navrhovanie sondy sú potrebné predchádzajúce znalosti sekvencie. |
| PCR | |
| PCR sa podieľa na RAPD | PCR nie je súčasťou RFLP. |
| Reprodukovateľnosť | |
| RAPD má nízku reprodukovateľnosť | RFLP má v porovnaní s RAPD vysokú reprodukovateľnosť. |
Zhrnutie – RAPD vs RFLP
RAPD a RFLP sú dôležité markery používané v molekulárnej biológii. Obe metódy sú schopné odhaliť genetické variácie medzi organizmami. RAPD sa uskutočňuje s použitím náhodných primérov. RFLP sa uskutočňuje s použitím špecifických reštrikčných enzýmov. Obe metódy vytvárajú profily DNA jedinečné pre jednotlivé organizmy. RAPD zahŕňa porovnateľne málo krokov ako RFLP. Poskytuje však menej spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky ako RFLP. Toto je hlavný rozdiel medzi RAPD a RFLP.
