Kľúčový rozdiel – AFLP vs RFLP
Štúdie DNA majú nesmierny význam pri porozumení a určovaní fylogenetických vzťahov, diagnostike genetických chorôb a mapovaní genómov organizmu. Niekoľko techník spojených s analýzou DNA sa používa aj na identifikáciu konkrétneho génu alebo sekvencie DNA v skupine neznámej DNA. Sú známe ako molekulárne markery. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) a Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) sú dva takéto molekulárne markery (metódy) vyvinuté v molekulárnej biológii na detekciu genetických variácií medzi organizmami. Obe metódy sú rovnako dôležité a majú výhody aj nevýhody. Kľúčový rozdiel medzi AFLP a RFLP je v tom, že AFLP zahŕňa selektívnu PCR amplifikáciu štiepenej DNA, zatiaľ čo RFLP nezahŕňa selektívnu PCR amplifikáciu fragmentov DNA.
Čo je AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) je dôležitým nástrojom v molekulárnej biológii a vo veľkej miere sa používa v analýze genetických variácií. AFLP je založená na špecifickej PCR amplifikácii fragmentovanej genómovej DNA a detekcii polymorfizmu autorádiografiou pomocou gélovej elektroforézy. AFLP široko prispieva k identifikácii genetických rozdielov v kmeňoch alebo blízko príbuzných druhoch rôznych kráľovstiev vrátane rastlín, zvierat, baktérií a húb. AFLP sa môže uskutočniť s malými množstvami neznámych vzoriek DNA. Nevyžaduje predchádzajúce znalosti o sekvencii a navrhovaní sond.
Kroky AFLP
- Izolácia DNA
- Strávenie DNA reštrikčnými endonukleázami
- Ligácia obmedzených fragmentov DNA pomocou adaptérov
- Selektívna amplifikácia fragmentov so špecifickými reštrikčnými miestami
- Separácia produktov PCR gélovou elektroforézou
- Vizualizácia gélovej matrice autorádiografom
AFLP je citlivejšia a reprodukovateľnejšia metóda, ktorú možno použiť pri profilovaní DNA niekoľkých taxónov vrátane húb, baktérií, rastlín a živočíchov bez predchádzajúcej znalosti sekvencií DNA. Pomáha pri identifikácii malých rozdielov medzi jednotlivcami v populáciách vďaka svojej vysoko citlivej povahe. AFLP je tiež dôležitá pri mapovaní genómu, forenzných štúdiách, testovaní rodičov, genotypizácii atď.
Obrázok 01: AFLP
Čo je RFLP?
Polymorfizmy dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP) je technika, ktorá sa používa na detekciu genetických variácií v homológnych sekvenciách DNA. Je to prvá metóda vyvinutá na profilovanie DNA. Organizmy majú jedinečné DNA odtlačky prstov alebo profily DNA. RFLP slúži ako dôležitý nástroj na analýzu variácií medzi profilmi DNA vnútrošpecifických alebo blízko príbuzných organizmov, pretože homológne sekvencie majú rôzne reštrikčné miesta (umiestnenia), ktoré sú jedinečné pre konkrétny organizmus. Keď sa homológna DNA štiepi špecifickými reštrikčnými endonukleázami, výsledkom budú rôzne profily DNA, ktoré sú jedinečné pre každého jednotlivca. Preto je princípom tejto metódy detekcia genetických variácií medzi organizmami reštrikciou homológnej DNA špecifickými reštrikčnými enzýmami a analýza polymorfizmu dĺžky fragmentov pomocou gélovej elektroforézy a blotovania. Vzory blotovania sú jedinečné pre každý organizmus a charakterizujú špecifické genotypy.
Kroky RFLP
- Izolácia dostatočného množstva DNA zo vzoriek
- Fragmentácia vzoriek DNA so špecifickými restrikčnými endonukleázami do krátkej sekvencie
- Separácia výsledných fragmentov s rôznymi dĺžkami elektroforézou na agarózovom géli.
- Prenos gélového profilu do membrány metódou Southern blotting
- Hybridizácia membrány so značenými sondami a analýza polymorfizmu dĺžky fragmentov v každom profile
RFLP je veľmi dôležitá technika pri zisťovaní dedičnosti choroby a zisťovaní rizika výskytu choroby medzi členmi rodiny. RFLP sa tiež často používa pri mapovaní genómu, identifikácii zločincov vo forenznej oblasti, testovaní otcovstva atď. RFLP má tiež niekoľko obmedzení. RFLP vyžaduje predchádzajúce znalosti sekvenčných údajov na navrhnutie sond na hybridizáciu. Vyžaduje tiež izoláciu dostatočného množstva DNA zo vzorky na analýzu, čo je pri forenzných štúdiách zložité.
Obrázok 01: mapovanie RRFLP
Aký je rozdiel medzi AFLP a RFLP?
ALFP vs RFLP |
|
| AFLP zahŕňa selektívnu PCR amplifikáciu štiepenej DNA. | RFLP nezahŕňa PCR, pokiaľ nejde o PCR-RFLP. |
| Sekvenčné znalosti | |
| Predchádzajúca znalosť sekvencie sa nevyžaduje. | Na navrhnutie sond RFLP sú potrebné predchádzajúce znalosti sekvencie. |
| Spoľahlivosť | |
| Toto je spoľahlivejšie. | Je to menej spoľahlivé v porovnaní s AFLP. |
| Účinnosť pri zisťovaní polymorfizmu | |
| Toto má vyššiu účinnosť pri zisťovaní polymorfizmu ako RFLP. | Je to menej efektívne v porovnaní s AFLP. |
| Cost | |
| V porovnaní s RFLP je to trochu drahé. | Je to lacnejšie v porovnaní s AFLP. |
| Aplikácie | |
| AFLPs boli aplikované na mapovanie genómu, DNA fingerprinting, štúdie genetickej diverzity, testovanie otcovstva a forenznú analýzu | RFLP analýza je dôležitým nástrojom pri mapovaní genómu, lokalizácii génov pre genetické poruchy, určovaní rizika ochorenia a testovaní otcovstva. |
Zhrnutie – AFLP vs RFLP
AFLP a RFLP sú dve techniky používané ako genetické markery na hodnotenie diverzity a hodnotenie genetických vzťahov v molekulárnej biológii. AFLP slúži ako účinná a citlivá metóda na detekciu genetického polymorfizmu medzi organizmami ako RFLP. Hoci obe tieto metódy majú rôznu účinnosť pri zisťovaní genetických variácií, stále sa používajú na odoberanie odtlačkov prstov DNA a diagnostiku chorôb.
