Kľúčový rozdiel – Nick Translation vs. Primer Extension
Preklad nicku a predlžovanie priméru sú dve dôležité techniky vykonávané v molekulárnej biológii. Kľúčový rozdiel medzi transláciou nicku a predlžovaním priméru je v tom, že proces translácie nicku produkuje značené sondy pre iné hybridizačné techniky, zatiaľ čo metóda predlžovania priméru identifikuje špecifickú sekvenciu RNA zo zmesi a odhaľuje informácie o expresii mRNA. Obe techniky majú veľký význam a bežne sa vykonávajú v molekulárnych výskumných laboratóriách.
Čo je to Nick Translation?
Nick translácia je dôležitá technika používaná na prípravu značených sond pre rôzne molekulárne biologické techniky, ako je blotovanie, in situ hybridizácia, fluorescenčná in situ hybridizácia atď. Ide o in vitro metódu značenia DNA. DNA sondy sa používajú na identifikáciu špecifických sekvencií DNA alebo RNA. Pomocou značenej sondy je možné označiť alebo zviditeľniť špecifické fragmenty z komplexnej zmesi nukleových kyselín. Preto sa značené sondy pripravujú pomocou rôznych techník, ktoré sa majú použiť pre rôzne techniky. Translácia Nicka je jednou z takýchto metód, ktorá produkuje značené sondy pomocou enzýmov DNázy 1 a DNA polymerázy 1.
Proces translácie nicku začína aktivitou enzýmu DNázy 1. DNáza 1 zavádza zárezy do fosfátového hlavného reťazca dvojvláknovej DNA štiepením fosfodiesterových väzieb medzi nukleotidmi. Po vytvorení nicku sa získa voľná 3'OH skupina nukleotidu a bude na ňu pôsobiť enzým DNA polymeráza 1. 5' až 3' exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy z nicku smerom k 3' smeru vlákna DNA. Súčasne funguje polymerázová aktivita enzýmu DNA polymeráza 1 a pridáva nukleotidy, ktoré nahradia odstránené nukleotidy. Ak boli nukleotidy označené, dôjde k nahradeniu označenými nukleotidmi a označí DNA na identifikáciu. Táto novo syntetizovaná značená DNA môže byť použitá ako sondy v rôznych hybridizačných reakciách v molekulárnej biológii.
Obrázok 01: Proces prekladu prezývok
Čo je rozšírenie Primer?
Primer extension je technika, ktorá sa používa na nájdenie špecifickej sekvencie RNA zo zmesi RNA a lokalizáciu 5' konca mRNA transkriptu. Používa sa tiež na štúdium štruktúry RNA a expresie. Metóda predlžovania priméru sa uskutočňuje so značenými primérmi alebo so značenými nukleotidmi. Ak sa použijú značené priméry, vylučuje to potrebu značenia nukleotidov, ktoré sa používajú na syntézu cDNA. V tejto technike je niekoľko krokov. Začína sa extrakciou RNA zo vzorky. Potom sa k zmesi pridá značený oligonukleotidový primér spolu s potrebnými zložkami na syntézu cDNA špecifickej sekvencie RNA. Primér žíha s komplementárnou sekvenciou zo zmesi. Použitím sekvencie anelovanej s primérom ako templátu syntetizuje enzým reverzná transkriptáza komplementárnu DNA (cDNA) sekvencie RNA. Annealing priméru a reverzná transkripcia nastávajú iba vtedy, keď je vo vzorke prítomná špecifická sekvencia RNA. Nakoniec, keď sa uskutoční denaturačná gélová elektroforéza, možno určiť veľkosť sekvencie RNA. Je tiež ľahké nájsť +1 bázu sekvencie mRNA (miesto iniciácie transkripcie) metódou predlžovania priméru. Množstvo mRNA prítomné vo vzorke je možné kvantifikovať touto metódou, ak sa použije nadbytočný primer.
Obrázok 02: Primer extension
Aký je rozdiel medzi prekladom Nick a rozšírením Primer?
Preklad prezývky vs. Rozšírenie Primer |
|
| Preklad nicku je proces, ktorý vytvára značené DNA sondy pre rôzne hybridizačné reakcie. | Primer extension je technika používaná na nájdenie špecifickej RNA alebo na štúdium génovej expresie. |
| Použité enzýmy | |
| Používajú sa enzýmy DNáza 1 a DNA polymeráza. | Používa sa enzým reverzná transkriptáza. |
| Dôležitosť | |
| Preklad prezývky uľahčuje označenie špecifickej sekvencie DNA. | Primer extension umožňuje detekciu špecifickej veľkosti sekvencie mRNA a množstva prítomného vo vzorke. |
Summary – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translácia je metóda používaná na syntézu značených sond založených na aktivitách enzýmov DNázy 1 a E coli DNA polymerázy 1. Je to metóda in vitro používaná v laboratóriách pred rôznymi hybridizačnými technikami. Počas translácie nicku 5'-3' exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy pred nickom a polymerázová aktivita DNA polymerázy 1 nahrádza odstránené nukleotidy značenými nukleotidmi za nickom. Predĺženie priméru je metóda, ktorá sa používa na detekciu špecifického transkriptu RNA zo zmesi a na kvantifikáciu veľkosti a množstva požadovanej RNA. Toto je rozdiel medzi prekladom nicku a predĺžením priméru.
