Kľúčový rozdiel medzi prekladom nicku a vyplnením konca je v tom, že translácia nicku je proces, ktorý vytvára značené sondy DNA pre rôzne hybridizačné reakcie, zatiaľ čo vypĺňanie konca je technika, ktorá vytvára otupené fragmenty pridaním nukleotidov do jednovláknových previsov.
Preklad nicku a vyplnenie konca sú dve techniky používané v molekulárnej biológii. Nick translácia sa používa na značenie sond na hybridizáciu, aby sa detegovali špecifické nukleotidové sekvencie. Koncová výplň sa používa na výrobu otupených úlomkov, ktoré mali lepkavé konce s jednovláknovými prevismi. Obe techniky majú veľký význam a bežne sa vykonávajú v molekulárnych výskumných laboratóriách.
Čo je to Nick Translation?
Nick translácia je dôležitá technika používaná na prípravu značených sond pre rôzne molekulárne biologické techniky, ako je blotovanie, in situ hybridizácia, fluorescenčná in situ hybridizácia atď. Ide o in vitro metódu značenia DNA. DNA sondy sa používajú na identifikáciu špecifických sekvencií DNA alebo RNA. Pomocou značenej sondy je možné označiť alebo zviditeľniť špecifické fragmenty z komplexnej zmesi nukleových kyselín. Preto sa značené sondy pripravujú rôznymi technikami. Translácia Nicka je jednou z takýchto metód, ktorá produkuje značené sondy pomocou enzýmov DNázy 1 a DNA polymerázy 1.
Obrázok 01: Preklad prezývky
Proces translácie nicku začína aktivitou enzýmu DNázy 1. DNáza 1 zavádza zárezy do fosfátového hlavného reťazca dvojvláknovej DNA štiepením fosfodiesterových väzieb medzi nukleotidmi. Po vytvorení nicku sa vytvorí voľná 3′ OH skupina nukleotidu, na ktorú bude pôsobiť enzým DNA polymeráza 1. 5′ až 3′ exonukleázová aktivita DNA polymerázy 1 odstraňuje nukleotidy z nicku smerom k 3′ smere vlákna DNA.
Súčasne funguje polymerázová aktivita enzýmu DNA polymeráza 1 a pridáva nukleotidy, ktoré nahradia odstránené nukleotidy. Ak sú nukleotidy označené, dôjde k nahradeniu označenými nukleotidmi a označí DNA na identifikáciu. Nakoniec sa táto novo syntetizovaná značená DNA môže použiť ako sondy v rôznych hybridizačných reakciách.
Čo je End Filling?
Koncové plnenie je technika používaná v molekulárnej biológii na vytváranie otupených fragmentov. Reštrikčné trávenie produkuje fragmenty s prevismi. Tieto fragmenty nemusia byť kompatibilné na ligáciu do plazmidových vektorov. Vektory sú často otupené, aby bolo možné spojiť nekompatibilné konce. Preto môžu byť fragmenty s presahmi otupené pridaním nukleotidov ku komplementárnemu vláknu s použitím presahu ako templátu pre polymerizáciu. Tento proces je známy ako koncové plnenie.
DNA polymerázy ako Klenow fragment DNA polymerázy I a T4 DNA polymerázy katalyzujú koncovú výplň. Pridávajú nukleotidy na vyplnenie (5′ → 3′) a žuvanie späť (3′ → 5′). Keď sú lepkavé konce vyplnené, stanú sa tupými a sú pripravené na ligáciu do vektora.
Okrem toho sa koncová výplň môže použiť na označenie molekúl DNA. Dá sa však použiť len na označenie molekúl DNA s lepkavými koncami. V porovnaní s prekladom nicku je vyplnenie konca jemnejšou metódou, ktorá len zriedka spôsobuje zlomy DNA.
Aké sú podobnosti medzi prekladom prezývok a vyplňovaním konca?
- Preklad nicku aj koncové vypĺňanie sú molekulárne biologické techniky.
- Dajú sa použiť na označenie sond.
- Obaja sú in vitro
Aký je rozdiel medzi prekladom prezývok a vyplňovaním konca?
Preklad nicku je technika, ktorá vytvára značené sondy na hybridizáciu. Na rozdiel od toho je koncová výplň technika, ktorá vytvára tupé fragmenty na ligáciu do vektorov. Toto je kľúčový rozdiel medzi prekladom prezývok a vyplňovaním konca. Okrem toho preklad Nicka vyžaduje použitie 5' až 3' exonukleázovej aktivity, zatiaľ čo koncové plnenie nevyžaduje 5' až 3' exonukleázovú aktivitu.
V infografike nižšie sú podrobnejšie uvedené rozdiely medzi prekladom prezývok a vyplňovaním konca.
Summary – Nick Translation vs End Filling
Nick translácia je metóda, ktorá zahŕňa rádioaktívne značené nukleotidy do DNA. Syntetizuje značené sondy na základe aktivít enzýmov DNázy 1 a DNA polymerázy 1 E. coli. Na druhej strane koncové plnenie je technika, ktorá vytvára tupé úlomky. Keď majú fragmenty lepkavé konce (jednovláknové previsy), je potrebné vytvoriť ich tupé konce, aby sa mohli ligovať do vektorov. Koncové plnenie pridáva kompatibilné nukleotidy a vytvára tupé koncové fragmenty, aby boli kompatibilné pre ligáciu. Toto sumarizuje rozdiel medzi prekladom nicku a vyplňovaním konca.
