Kľúčový rozdiel – T4 vs T7 DNA ligáza
DNA ligáza je dôležitý enzým používaný v technikách molekulárnej biológie. Funguje ako molekulárne lepidlo na spojenie nukleotidov vytváraním fosfodiesterových väzieb medzi nukleotidmi. Fosfodiesterové väzby sa tvoria medzi 3' hydroxylovým koncom cukrovej skupiny a 5' koncovou fosfátovou skupinou. DNA ligáza je životne dôležitá v procese replikácie na spojenie Okazakiho fragmentov zaostávajúceho vlákna a počas mechanizmov opravy DNA a in vitro klonovacích experimentov na pripojenie požadovaného génu k vektorovému genómu. Molekulárny biológovia v súčasnosti používajú dve hlavné DNA ligázy: DNA ligázy T4 a T7. T4 DNA ligáza je jedným z prvých enzýmov, ktoré boli izolované z T4 bakteriofágu. T7 DNA ligáza, čo je menší proteín, je enzým izolovaný z T7 bakteriofága. Toto je kľúčový rozdiel medzi T4 a T7 DNA ligázami.
Ako pôsobí DNA ligáza?
Ligácia DNA prebieha v troch krokoch. Prvým krokom je nukleofilný útok na alfa-fosfor ATP vytvárajúci kovalentný enzým-adenylátový medziprodukt, v ktorom je AMP spojený s dusíkom koncového bočného reťazca lyzínu. V druhom kroku dochádza k nukleofilnému útoku na fosfor enzýmu-adenylátu substrátom DNA zakončeným 5'-fosfátom, pričom sa uvoľňuje lyzín a vytvára sa DNA-adenylát. V poslednom kroku je DNA-adenylát napadnutý 3'-OH iného vlákna DNA, čím sa uvoľní AMP a spoja sa polynukleotidy.
Čo je T4 DNA ligáza?
T4 ligáza bola prvou ligázou, ktorú izolovali a identifikovali Meselson, Weigle a Kellenberger, a bola vôbec prvou komerčne vyrobenou ligázou. T4 DNA ligáza je enzým závislý od ATP, ktorý katalyzuje tvorbu fosfodiesterovej väzby. Je to jediný polypeptidový reťazec so 487 aminokyselinovými zvyškami a má molekulovú hmotnosť približne 77 kDa. Optimálne pH pre jeho aktivitu leží v rozmedzí 7,5 – 8.
Obrázok 01: T4 DNA ligáza
T4 DNA ligáza, ako naznačuje jej názov, je prítomná v bakteriofágu T4 a bola izolovaná, keď fág produkoval enzým po infekcii E. coli. Enzým spája dvojvláknové duplexy DNA s tupými koncami a fragmenty, ktoré sa majú viazať, by mali byť vo vzájomnej tesnej blízkosti.
Čo je T7 DNA ligáza?
T7 ligáza je 41 kDa proteín produkovaný bakteriofágom T7 a je izolovaný infikovaním buniek E. coli. Hlavnou funkciou T7 ligázy je ligácia duplexov DNA cez fosfodiesterové väzby a spojenie blízkych fragmentov DNA počas klonovacích experimentov. Optimálne pH pre T7 DNA ligázu leží v rozmedzí 7,0 – 7,2. T7 ligáza je závislá od ATP. T7 DNA ligázy sú tiež schopné spájať hybridy DNA a RNA, čo vedie k abnormálnym konformáciám počas transkripcie; tento jav je však stále predmetom výskumu in vitro štúdií.
Aké sú podobnosti medzi T4 a T7 DNA ligázou?
- T4 a T7 DNA ligáza sa zúčastňuje ligačnej reakcie aneláciou duplexov DNA prostredníctvom tvorby fosfodiesterovej väzby medzi 3' OH koncom a 5' fosfátovým koncom fragmentu DNA.
- Oba enzýmy ligujú duplexy DNA s tupými koncami, ktoré sú vo vzájomnej tesnej blízkosti.
- Oba enzýmy sú závislé od ATP.
- Tieto enzýmy sa izolujú infikovaním buniek E. coli konkrétnym bakteriofágom.
- Aplikácie oboch enzýmov zahŕňajú:
- Molekulárne klonovanie – na ligáciu požadovaného génu s vektorom
- Oprava DNA – na opravu dvojvláknových výklenkov
- Replikácia DNA in vitro
- Ligasová reťazová reakcia
Aký je rozdiel medzi T4 a T7 DNA ligázou?
T4 vs T7 DNA ligáza |
|
| T4 DNA ligáza typ DNA ligázy izolovanej z bakteriofágu T4 a podieľa sa na ligácii susedných fragmentov DNA prostredníctvom tvorby fosfodiesterovej väzby. | T7 DNA ligáza typ DNA ligázy izolovanej z bakteriofágu T7 a podieľa sa na ligácii susedných fragmentov DNA prostredníctvom tvorby fosfodiesterovej väzby. |
| Veľkosť bielkovín | |
| Veľkosť T4 DNA ligázy je 77 kDa – väčšia v porovnaní s T7 DNA ligázou. | Veľkosť T7 DNA ligázy je 41 kDa. |
| Optimálne pH | |
| rozsah pH, ktorý funguje T4 DNA ligáza je 7,5 – 8,0. | rozsah pH, ktorý funguje T7 DNA ligáza je 7,0 – 7,2. |
Zhrnutie – T4 vs T7 DNA ligáza
DNA ligázy sú dôležitou triedou enzýmov zapojených do molekulárneho klonovania na produkciu rekombinantných molekúl DNA obsahujúcich požadovaný gén. Ligačná reakcia je reakcia využívajúca energiu a prebiehajú nové výskumné štúdie na zlepšenie presnosti moduláciou dostupných ligáz. T4 a T7 DNA ligázy sú dva typy dôležitých DNA ligázových enzýmov používaných v technikách molekulárnej biológie. T7 DNA ligáza je tiež výsledkom výskumu, ktorý bol založený na primárnej ligáze izolovanej z T4 infikovaných E. coli. T7 sa vyznačuje vyššou efektívnosťou a presnosťou pri vykonávaní svojej funkcie vďaka svojej menšej veľkosti. Toto je rozdiel medzi T4 a T7 ligázou.
Stiahnuť PDF verziu T4 vs T7 DNA Ligase
Môžete si stiahnuť PDF verziu tohto článku a použiť ju na offline účely podľa citácií. Stiahnite si PDF verziu tu Rozdiel medzi T4 a T7 Ligase.
