Kľúčový rozdiel – ligácia tupého a lepkavého konca
Reštrikčné endonukleázy sú špecifické enzýmy, ktoré štiepia dvojvláknovú DNA (dsDNA). V molekulárnej biológii sú tiež známe ako molekulárne nožnice. Reštrikčné enzýmy sú schopné rozpoznať špecifické krátke sekvencie dsDNA známe ako rozpoznávacie miesta a štiepia fosfodiesterové a vodíkové väzby na otvorené dvojité vlákna. V dôsledku štiepenia týmito enzýmami sa vytvárajú fragmenty DNA s rôznymi typmi koncov, ako sú lepkavé konce a tupé konce. DNA ligáza je enzým používaný v molekulárnej biológii na spojenie dvoch susedných reťazcov DNA vytvorením nových väzieb. Tento krok je známy ako ligácia a podľa typu ligovaného konca DNA sa môže označovať ako ligácia tupých koncov a ligácia lepivých koncov. Kľúčový rozdiel medzi ligáciou tupých a lepivých koncov je v tom, že k ligácii tupých koncov dochádza medzi fragmentmi DNA, ktoré obsahujú dva tupé konce, zatiaľ čo ligácia lepivých koncov nastáva medzi 5' a 3' prevismi. V porovnaní s ligáciou tupých koncov je ligácia lepivých koncov efektívnejšia a stabilnejšia.
Čo je ligácia tupého konca?
Niektoré reštrikčné endonukleázy môžu štiepiť DNA na opačných bázach a vytvárať fragmenty DNA s tupými koncami. Tieto enzýmy sú známe ako frézy s tupými koncami; štiepia sa priamo do stredu reštrikčného miesta bez zanechania jednovláknových previsnutých báz. Tupé konce sú tiež známe ako neprečnievajúce konce, pretože na koncoch nemajú 3 'a 5 ' presahujúce základne. Obidve vlákna končia z párov báz tupými koncami. Bežné enzýmy na rezanie tupým koncom sú EcoRV HaeIII, AluI a Smal.
Podviazanie tupého konca sa nachádza medzi dvoma tupými koncami. Nejde o podviazanie vyčnievajúcich báz. Táto ligácia je menej účinná ako ligácia lepivých koncov. V niektorých prípadoch sa však ligácia tupých koncov stáva výhodnejšou ako ligácia lepivých koncov, najmä pri ligácii produktov PCR. Produkty PCR sa vždy vyrábajú s tupými koncami. Ligácia tupých koncov nevyžaduje na ligáciu komplementárne konce v DNA.
Obrázok 01: Výroba tupého konca enzýmom Eco RV
Čo je ligácia lepkavého konca?
Niektoré reštrikčné endonukleázy sú schopné rozrezať dsDNA, pričom na konci ponechajú previsnutý kúsok jednovláknovej DNA. Tieto konce sú známe ako lepkavé alebo previsnuté konce. K ligácii lepivých koncov dochádza medzi dvoma fragmentmi DNA, ktoré obsahujú zodpovedajúce presahy, pretože lepkavé konce majú nepárové bázy a na vytvorenie väzieb vyžadujú komplementárne bázy. Preto je potrebné použiť rovnaký reštrikčný enzým pre oba zdroje DNA, aby sa vytvorili zodpovedajúce ligačné fragmenty.
Podviazanie lepkavých koncov je efektívnejšie a je často veľmi žiaduce pri klonovacích procesoch. Existuje niekoľko reštrikčných enzýmov, ktoré produkujú lepkavé konce. Sú to EcoRI, BamHI, HindIII atď.
Obrázok 02: Výroba lepivých koncov pomocou enzýmu Eco RI
Aký je rozdiel medzi ligáciou tupého a lepkavého konca?
Tupá vs. Ligácia s lepkavým koncom |
|
| Ligácia tupých koncov nastáva medzi dvoma fragmentmi DNA s tupými koncami. | K ligácii lepivých koncov dochádza medzi dvoma zodpovedajúcimi fragmentmi DNA s lepkavými koncami. |
| Enzýmy | |
| Rezačky s tupými koncami vytvárajú tupé konce. | Orezávače na lepivé konce vytvárajú lepkavé alebo súdržné konce. |
| Požiadavka konca zhody | |
| Nevyžaduje zhodujúce sa fragmenty ani komplementárne bázy. | Na vytvorenie párov báz si vyžaduje komplementárne bázy na koncoch. |
| Efficiency | |
| Je to menej účinné ako ligácia lepkavých koncov | Je to efektívnejšie ako ligácia tupých koncov. |
Zhrnutie – Tupá vs. ligácia s lepkavým koncom
Reštrikčné endonukleázy sú schopné štiepiť dsDNA a vytvárať fragmenty DNA s rôznymi koncami. Rozpoznávajú špecifické sekvencie a obmedzujú DNA, čím vytvárajú lepkavé a tupé konce. Lepkavé konce majú na konci úlomkov nepárové bázy. Tupé konce sú vytvorené vďaka rovnému štiepeniu a na koncoch majú páry báz. Ligácia lepivých koncov vyžaduje dva komplementárne kusy jednovláknovej DNA. K ligácii tupých koncov dochádza medzi akýmikoľvek dvoma fragmentmi tupých koncov. Toto je rozdiel medzi tupou a lepkavou ligáciou.
