Kľúčový rozdiel – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green a Taqman sú dve metódy používané na detekciu alebo sledovanie procesu amplifikácie PCR v reálnom čase. SYBR Green je metóda založená na interkalovanom farbení nukleových kyselín, zatiaľ čo Taqman je metóda založená na hydrolyzačnej sonde. Obe technológie sú navrhnuté tak, aby generovali fluorescenciu počas PCR, čo umožňuje stroju PCR v reálnom čase monitorovať reakciu v „reálnom čase“. Metóda SYBR Green sa vykonáva pomocou fluorescenčného farbiva nazývaného SYBR green a deteguje amplifikáciu naviazaním farbiva na produkovanú dvojvláknovú DNA. Taqman sa uskutočňuje s použitím duálne značených sond a deteguje amplifikáciu degradáciou sondy Taq polymerázou a uvoľnením fluorofóru. Toto je kľúčový rozdiel medzi SYBR Green a Taqman.
Čo je SYBR Green?
SYBR Green je fluorescenčné farbivo používané na farbenie nukleových kyselín, najmä dvojvláknovej DNA v molekulárnej biológii. Metóda SYBR Green sa používa na kvantifikáciu produktov PCR počas PCR v reálnom čase. Akonáhle sa naviaže na DNA, výsledný komplex DNA-farbivo absorbuje modré svetlo a vyžaruje intenzívne zelené svetlo. Stáva sa to v dôsledku štrukturálnej zmeny, ku ktorej dochádza v molekule farbiva po naviazaní na dvojvláknovú DNA. Keď PCR vytvára viac a viac DNA, viac molekúl farbiva sa viaže s DNA, čím sa vytvára viac fluorescencie. Preto sa fluorescencia zvyšuje s akumuláciou produktu PCR. Množstvo produktu PCR možno teda kvantitatívne merať pomocou detekcie zelenej fluorescencie SYBR.
Zelené farbivo SYBR možno použiť aj na značenie DNA v cytometrii a fluorescenčnej mikroskopii. Etídium bromid bol úspešne nahradený SYBR Green, pretože etídium bromid je karcinogénne farbivo s problémami s likvidáciou počas vizualizácie DNA v gélovej elektroforéze.
Existujú výhody a nevýhody zelenej metódy SYBR. Táto metóda je veľmi citlivá, lacná a ľahko sa používa. Avšak vďaka svojej schopnosti viazať sa na akúkoľvek dvojvláknovú DNA môže nešpecifická väzba viesť k nadmernej kvantifikácii produktu PCR.
Obrázok 01: Zelená technika SYBR
Čo je Taqman?
Taqman je alternatívna metóda k SYBR Green na monitorovanie procesu PCR v reálnom čase. Táto metóda závisí od 5' – 3' exonukleázovej aktivity enzýmu Taq polymerázy na degradáciu sond počas predlžovania nového vlákna a uvoľňovania fluorofóru. Pri tejto metóde sa používajú duálne značené sondy a je založená na hydrolýze sond. Sondy sú fluorescenčne značené DNA oligonukleotidy, ktoré majú fluorescenčnú reportérovú molekulu (fluorofór) na 5' konci a zhášajúcu molekulu na 3' konci. Sú navrhnuté tak, aby sa viazali na jednovláknový templát na opačnej strane anelácie priméru. Taq polymeráza pridáva nukleotidy k priméru a predlžuje nové vlákno smerom k duálne značeným sondám. Akonáhle sa Taq polymeráza stretne so sondou, exonukleázové pôsobenie Taq polymerázy aktivuje a degraduje sondu. Po dokončení syntézy nového vlákna sa sonda podrobí úplnej degradácii a uvoľní sa fluorofór. Uvoľnenie fluorofóru generuje fluorescenciu. Fluorescenčná molekula zhášača účinne zháša emitované svetlo a vytvára výstup na kvantifikáciu produktu PCR. Uvoľňovanie fluorofórov a množstvo produktov PCR sú úmerné. Preto je možné kvantifikáciu jednoducho vykonať metódou Taqman.
Obrázok 02: Metóda Taqman
Taqman metóda sa používa v real-time PCR, kvantifikácii génovej expresie, detekcii genetických polymorfizmov, kvantifikácii delécií chromozomálnej DNA, identifikácii baktérií, verifikácii microarray analýzy, SNP genotypizácii atď.
Aký je rozdiel medzi SYBR green a Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green je založená na farbive viažucom DNA. | Taqman závisí od hybridizačných sond a 5' až 3' exonukleázovej aktivity Taq polymerázy. |
| Fluorescenčne značené sondy | |
| Nie sú potrebné žiadne fluorescenčne označené sondy. | Vyžadujú sa sondy s dvojitým označením. |
| Multiplexná génová analýza | |
| Nedá sa použiť pre ciele multiplexných génov. | Môže byť použitý pre multiplexné génové ciele. |
| Cost | |
| Je to lacnejšie. | Toto je drahšie. |
| Špecifickosť | |
| Toto je menej špecifické a viaže sa na akúkoľvek dvojvláknovú DNA | Sú vysoko špecifické, pretože sondy detegujú špecifické amplifikačné produkty. |
| Efektívnosť | |
| Toto je menej efektívne. | Toto je vysoko efektívne. |
| Aplikácia | |
| Používa sa pri real-time PCR, vizualizácii na agarózovom géli, označovaní DNA atď. | Toto sa používa pri real-time PCR, kvantifikácii génovej expresie, detekcii genetických polymorfizmov atď. |
Zhrnutie – SYBR Green a Taqman
Taqman a SYBR green sú dve metódy používané v real-time PCR (kvantitatívna PCR). Obidve metódy umožňujú efektívnu kvantifikáciu produktu PCR a spoliehajú sa na emisiu fluorescencie. Metóda Taqman využíva duálne značené sondy na detekciu nahromadenej DNA, zatiaľ čo metóda SYBR Green používa fluorescenčné farbivo. Obe tieto metódy majú tiež rôzne aplikácie v molekulárnej biológii.
