Kľúčový rozdiel – NGS oproti Sangerovmu sekvenovaniu
Sekvenovanie novej generácie (NGS) a Sangerovo sekvenovanie sú dva typy techník sekvenovania nukleotidov vyvinuté v priebehu času. Metóda Sanger Sequencing bola široko používaná mnoho rokov a NGS ju nedávno nahradila kvôli jej výhodám. Kľúčový rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvenovaním je v tom, že NGS funguje na princípe sekvenovania miliónov sekvencií súčasne rýchlym spôsobom prostredníctvom sekvenčného systému, zatiaľ čo Sangerove sekvenovanie funguje na princípe ukončenia reťazca vďaka selektívnemu začleneniu dideoxynukleotidov enzýmom DNA polymerázou. počas replikácie DNA a výslednej separácie fragmentov kapilárnou elektroforézou.
Čo je sekvenovanie nukleotidov?
Genetická informácia je uložená v nukleotidových sekvenciách DNA alebo RNA organizmu. Proces určenia správneho poradia nukleotidov (pomocou štyroch báz) v danom fragmente (v géne, zhluku génov, chromozóme a kompletnom genóme) je známy ako sekvenovanie nukleotidov. V genomických štúdiách, forenzných štúdiách, virológii, biologickej systematike, lekárskej diagnostike, biotechnológii a v mnohých iných oblastiach je veľmi dôležité analyzovať štruktúru a funkciu génov. Vedci vyvinuli rôzne typy sekvenčných metód. Spomedzi nich bolo sekvenovanie Sanger vyvinuté Frederickom Sangerom v roku 1977 široko používané a popularizované na dlhú dobu, kým ho nenahradilo sekvenovanie novej generácie.
Čo je NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) je termín používaný na označenie moderných vysokovýkonných sekvenčných procesov. Opisuje množstvo rôznych moderných sekvenčných technológií, ktoré spôsobili revolúciu v genómových štúdiách a molekulárnej biológii. Týmito technikami sú sekvenovanie Illumina, sekvenovanie Roche 454, sekvenovanie iónových protónov a sekvenovanie SOLiD (sekvenovanie pomocou detekcie oligoligácie). Systémy NGS sú rýchlejšie a lacnejšie. V systémoch NGS sa používajú štyri hlavné metódy sekvenovania DNA, a to; pyrosekvenovanie, sekvenovanie syntézou, sekvenovanie ligáciou a sekvenovanie iónových polovodičov. Paralelne možno sekvenovať veľké množstvo reťazcov DNA alebo RNA (milióny). Umožňuje sekvenovanie celého genómu organizmov v krátkom časovom období, na rozdiel od Sangerovho sekvenovania, ktoré si vyžaduje viac času.
NGS má oproti konvenčnej Sangerovej metóde sekvenovania mnoho výhod. Je to vysokorýchlostný, presnejší a nákladovo efektívnejší proces, ktorý možno vykonať s malou veľkosťou vzorky. NGS sa môže použiť v metagenomických štúdiách, pri zisťovaní variácií v rámci individuálneho genómu v dôsledku inzercií a delécií atď. a pri analýze génových expresií.
Obrázok_1: Vývoj v sekvenovaní NGS
Čo je Sangerovo sekvenovanie?
Sangerove sekvenovanie je metóda sekvenovania vyvinutá Frederickom Sangerom a jeho kolegami v roku 1977 na určenie presného poradia nukleotidov daného fragmentu DNA. Je tiež známy ako sekvenovanie ukončenia reťazca alebo Dideoxy sekvenovanie. Pracovným princípom tejto metódy je ukončenie syntézy vlákna selektívnym začlenením dideoxynukleotidov ukončujúcich reťazec (ddNTP), ako sú ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, pomocou DNA polymerázy počas replikácie DNA. Normálne nukleotidy majú 3' OH skupiny na vytvorenie fosfodiesterovej väzby medzi susednými nukleotidmi, aby pokračovala tvorba vlákna. Avšak ddNTP postrádajú túto 3'OH skupinu a nie sú schopné vytvárať fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi. Preto sa predlžovanie reťaze zastaví.
Pri tejto metóde jednovláknová DNA, ktorá sa má sekvenovať, slúži ako templátový reťazec pre syntézu DNA in vitro. Ďalšími požiadavkami sú oligonukleotidový primér, deoxynukleotidové prekurzory a enzým DNA polymeráza. Keď sú známe lemujúce konce cieľového fragmentu, priméry možno ľahko navrhnúť na replikáciu DNA. V štyroch samostatných skúmavkách sa uskutočnia štyri samostatné reakcie syntézy DNA. Každá skúmavka má samostatné ddNTP spolu s ďalšími požiadavkami. Z konkrétneho nukleotidu sa pridá zmes dNTP a ddNTP. Podobne sa uskutočnia štyri samostatné reakcie v štyroch skúmavkách so štyrmi zmesami. Po reakciách sa uskutoční detekcia fragmentov DNA a konverzia vzoru fragmentov na sekvenčnú informáciu. Výsledné fragmenty DNA sa tepelne denaturujú a separujú gélovou elektroforézou. Ak sa použijú rádioaktívne nukleotidy, vzor pruhov v polyakrylamidovom géli možno vizualizovať autorádiografiou. Keď táto metóda používa fluorescenčne značené dideoxynukleotidy, môže byť zmiernená po odčítaní gélu a prejdená cez lúč lasera, aby bola detekovaná fluorescenčným detektorom. Aby sa predišlo chybám, ktoré by mohli nastať pri čítaní sekvencie okom a manuálnom zadávaní do počítača, táto metóda sa vyvinula do použitia automatického sekvencera spojeného s počítačom.
Toto je metóda používaná na sekvenovanie DNA z projektu Human Genome. Táto metóda sa stále používa s pokročilými úpravami, pretože poskytuje presné informácie o sekvencii napriek tomu, že ide o drahý a pomalý proces.
Figure_2: Sanger Sequencing
Aký je rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvenovaním?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) označujú moderné vysokovýkonné sekvenčné procesy. Popisuje množstvo rôznych moderných sekvenčných technológií | Sangerove sekvenovanie je metóda sekvenovania vyvinutá Frederickom Sangerom na určenie presného poradia nukleotidov daného fragmentu DNA. |
| Nákladová efektívnosť | |
| NGS je lacnejší proces, pretože znižuje čas, ľudskú silu a chemikálie. | Je to nákladný proces, pretože si vyžaduje čas, ľudskú silu a viac chemikálií. |
| Speed | |
| Je to rýchlejšie, pretože chemická detekcia aj detekcia signálov mnohých vlákien prebiehajú paralelne. | Je to časovo náročné, pretože chemická detekcia a detekcia signálu prebiehajú ako dva oddelené procesy a súčasne je možné čítať iba na reťazci. |
| Spoľahlivosť | |
| NGS je spoľahlivý. | Sangerove sekvenovanie je menej spoľahlivé |
| Veľkosť vzorky | |
| NGS vyžaduje menšie množstvo DNA. | Táto metóda vyžaduje veľké množstvo templátovej DNA. |
| Bázy DNA na sekvenovaný fragment | |
| Počet báz DNA na sekvenovaný fragment je nižší ako pri Sangerovej metóde | Generujúce sekvencie sú dlhšie ako sekvencie NGS. |
Summary – NGS vs Sanger Sequencing
NGS a Sangerove sekvenovanie sú techniky sekvenovania nukleotidov, ktoré sa vo veľkej miere používajú v molekulárnej biológii. Sangerovo sekvenovanie je skorá sekvenačná metóda, ktorá bola nahradená NGS. Hlavný rozdiel medzi NGS a Sangerovým sekvenovaním je v tom, že NGS je vysokorýchlostný, presnejší a nákladovo efektívnejší proces ako Sangerove sekvenovanie. Obe techniky spôsobili veľké ohniská v genetike a biotechnológii.
