Kľúčový rozdiel – Sangerovo sekvenovanie verzus pyrosekvenovanie
Sekvenovanie DNA je pre analýzu DNA veľmi dôležité, pretože znalosť správneho usporiadania nukleotidov v konkrétnej oblasti DNA o nej odhaľuje veľa dôležitých informácií. Existujú rôzne metódy sekvenovania DNA. Sangerovo sekvenovanie a pyrosekvenovanie sú dve rôzne metódy sekvenovania DNA široko používané v molekulárnej biológii. Kľúčový rozdiel medzi Sangerovým sekvenovaním a pyrosekvenovaním je v tom, že Sangerove sekvenovanie používa dideoxynukleotidy na ukončenie syntézy DNA na prečítanie nukleotidovej sekvencie, zatiaľ čo pyrosekvenovanie deteguje uvoľňovanie pyrofosfátu začlenením nukleotidov a syntetizovaním komplementárnej sekvencie na prečítanie presného poradia sekvencie.
Čo je Sangerovo sekvenovanie?
Sangerove sekvenovanie je metóda sekvenovania DNA prvej generácie, ktorú vyvinul Frederick Sanger a jeho vysoké školy v roku 1977. Je tiež známa ako sekvenovanie ukončenia reťazcov alebo Dideoxy sekvenovanie, pretože je založené na ukončení reťazca dideoxynukleotidmi (ddNTP). Táto metóda bola široko používaná viac ako 30 rokov, kým nebolo vyvinuté sekvenovanie novej generácie (NGS). Sangerova sekvenačná technika umožnila objavenie správneho poradia nukleotidov alebo pripojenie konkrétneho fragmentu DNA. Je založená na selektívnom začlenení ddNTP a ukončení syntézy DNA počas in vitro replikácie DNA. Neprítomnosť 3' OH skupín na pokračovanie tvorby fosfodiesterovej väzby medzi susednými nukleotidmi je jedinečnou vlastnosťou ddNTP. Akonáhle je teda ddNTP pripojený, predlžovanie reťazca končí a končí od tohto bodu. V Sangerovom sekvenovaní sa používajú štyri ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP. Tieto nukleotidy zastavujú proces replikácie DNA, keď sú začlenené do rastúceho vlákna DNA a výsledkom sú rôzne dĺžky krátkej DNA. Kapilárna gélová elektroforéza sa používa na usporiadanie týchto krátkych reťazcov DNA podľa ich veľkosti na géli, ako je znázornené na obrázku 01.
Obrázok 1: Kapilárna gélová elektroforéza syntetizovanej krátkej DNA
Na replikáciu DNA in vitro by malo byť uvedených niekoľko požiadaviek. Sú to enzým DNA polymeráza, templátová DNA, oligonukleotidové priméry a deoxynukleotidy (dNTP). Pri Sangerovom sekvenovaní sa replikácia DNA uskutočňuje v štyroch samostatných skúmavkách spolu so štyrmi typmi ddNTP oddelene. Deoxynukleotidy nie sú úplne nahradené príslušnými ddNTP. Zmes konkrétneho dNTP (napríklad; dATP + ddATP) je vložená do skúmavky a replikovaná. Štyri oddelené skúmavky sa nanesú na gél v štyroch oddelených jamkách. Potom prečítaním gélu možno zostaviť sekvenciu, ako je znázornené na obrázku 02.
Obrázok 02: Sangerovo sekvenovanie
Sangerove sekvenovanie je dôležitá technika, ktorá pomáha v mnohých oblastiach molekulárnej biológie. Projekt ľudského genómu bol úspešne dokončený pomocou metód založených na Sangerovom sekvenovaní. Sangerove sekvenovanie je tiež užitočné pri sekvenovaní cieľovej DNA, výskume rakoviny a genetických chorôb, analýze génovej expresie, identifikácii ľudí, detekcii patogénov, mikrobiálnom sekvenovaní atď.
Sangerove sekvenovanie má niekoľko nevýhod:
- Dĺžka sekvenovanej DNA nemôže byť dlhšia ako 1000 párov báz
- Naraz je možné sekvenovať iba jeden reťazec.
- Proces je časovo náročný a drahý.
Preto boli postupom času vyvinuté nové pokročilé techniky sekvenovania na prekonanie týchto problémov. Sangerove sekvenovanie sa však stále používa vďaka svojim vysoko presným výsledkom až do dĺžky fragmentov približne 850 párov báz.
Čo je pyrosekvenovanie?
Pyrosekvenovanie je nová technika sekvenovania DNA založená na „sekvenovaní syntézou“. Táto technika sa spolieha na detekciu uvoľňovania pyrofosfátu po inkorporácii nukleotidu. Proces využívajú štyri rôzne enzýmy: DNA polymér, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza a dva substráty adenozín 5' fosfosulfát (APS) a luciferín.
Proces začína väzbou priméru s templátom jednovláknovej DNA a DNA polymeráza spustí inkorporáciu nukleotidov, ktoré sú k nemu komplementárne. Keď sa nukleotidy spoja (polymerizácia nukleových kyselín), uvoľnia sa pyrofosfátové (dve fosfátové skupiny spojené dohromady) a energia. Každé pridanie nukleotidu uvoľní ekvimolárne množstvo pyrofosfátu. Pyrofosfát sa konvertuje na ATP pomocou ATP sulfurylázy v prítomnosti substrátu APS. Generovaný ATP riadi luciferázou sprostredkovanú konverziu luciferínu na oxyluciferín, pričom produkuje viditeľné svetlo v množstvách, ktoré sú úmerné množstvu ATP. Svetlo je detegované zariadením na detekciu fotónov alebo fotonásobičom a vytvára pyrogram. Apyráza degraduje ATP a neinkorporované dNTP v reakčnej zmesi. Pridávanie dNTP sa vykonáva raz za čas. Pretože pridanie nukleotidu je známe podľa inkorporácie a detekcie svetla, môže byť určená sekvencia templátu. Pyrogram sa používa na vytvorenie nukleotidovej sekvencie vzorky DNA, ako je znázornené na obrázku 03.
Pyrosekvenovanie je veľmi dôležité pri analýze polymorfizmu jedného nukleotidu a sekvenovaní krátkych úsekov DNA. Vysoká presnosť, flexibilita, jednoduchosť automatizácie a paralelné spracovanie sú výhody pyrosekvenovania oproti Sangerovým sekvenčným technikám.
Obrázok 03: Pyrosekvenovanie
Aký je rozdiel medzi Sangerovým sekvenovaním a pyrosekvenovaním?
Sangerove sekvenovanie vs pyrosekvenovanie |
|
| Sangerove sekvenovanie je metóda sekvenovania DNA založená na selektívnom začlenení ddNTP pomocou DNA polymerázy a ukončení reťazca. | Pyrosequencing je metóda sekvenovania DNA založená na detekcii uvoľňovania pyrofosfátu po inkorporácii nukleotidu. |
| Používanie ddNTP | |
| ddNTP sa používajú na ukončenie replikácie DNA | ddNTP sa nepoužívajú. |
| Zapojené enzýmy | |
| Používa sa DNA polymeráza. | Používajú sa štyri enzýmy: DNA polymeráza, ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza. |
| Použité substráty | |
| APS a luciferín sa nepoužívajú. | Používa sa adenozín 5' fosfosulfát (APS) a luciferín. |
| Maximálna teplota | |
| Toto je pomalý proces. | Toto je rýchly proces. |
Zhrnutie – Sangerove sekvenovanie vs pyrosekvenovanie
Sangerove sekvenovanie a pyrosekvenovanie sú dve metódy sekvenovania DNA používané v molekulárnej biológii. Sangerove sekvenovanie vytvára poradie nukleotidov v sekvencii ukončením predlžovania reťazca, zatiaľ čo pyrosekvenovanie konštruuje presné poradie nukleotidov v sekvencii začlenením nukleotidov a detekciou uvoľňovania pyrofosfátov. Hlavným rozdielom medzi Sangerovým sekvenovaním a pyrosekvenovaním je preto to, že Sangerove sekvenovanie funguje na sekvenovaní ukončením reťazca, zatiaľ čo pyrosekvenovanie funguje na sekvenovaní syntézou.
