Kľúčový rozdiel medzi gélovou filtráciou a afinitnou chromatografiou je v tom, že gélová filtračná chromatografia závisí od rozdielov v molekulovej hmotnosti alebo veľkosti vzorky analytu, zatiaľ čo afinitná chromatografia závisí od afinity analytu k imobilizovanému ligandu.
Pojem chromatografia v analytickej chémii označuje proces separácie zložiek v zmesi pomocou rôznych techník. Chromatografia je súhrnný názov, ktorý predstavuje rôzne množstvo rôznych metód separácie.
Čo je gélová filtračná chromatografia?
Gélová filtračná chromatografia je analytická technika, pri ktorej separácia zložiek závisí od rozdielu v molekulovej hmotnosti alebo veľkosti. Táto technika je tiež známa ako vylučovacia chromatografia alebo chromatografia s molekulovým sitom. Separačná technika v tomto procese závisí od rozdielnej schopnosti molekúl vo vzorke vstúpiť do pórov gélového filtračného média.
Pri technike gélovej filtrácie obsahuje stacionárna fáza guľôčky hydratovaného špongiovitého materiálu s pórmi molekulárnych rozmerov s úzkym rozsahom veľkostí. Ak vodný roztok pozostávajúci z molekúl rôznych veľkostí prepustíme kolónou obsahujúcou tieto „molekulárne sitá“, molekuly, ktoré sú väčšie ako póry filtračného média, sa kolónou rýchlo pohybujú. Na rozdiel od toho menšie molekuly vstupujú do pórov gélu a majú tendenciu pomaly sa pohybovať cez kolónu. Molekuly sa eluujú z kolóny v poradí klesajúcej veľkosti molekuly. Tu je vylučovací limit gélu molekulová hmotnosť najmenších molekúl, ktoré nie sú schopné preniknúť do pórov daného gélu.
Existujú rôzne typy techník gélovej filtrácie, ako je nepriama gélová filtrácia, gélová filtrácia v ustálenom stave, gélová guľôčková dialýza atď. Nepriama gélová filtračná chromatografia je užitočná na stanovenie voľných hormónov štítnej žľazy. Gélová filtračná chromatografia v ustálenom stave je nepriama technika užitočná najmä na meranie voľných steroidov ako kortizol, testosterón atď. Gélová guľôčková dialýza je na druhej strane modifikáciou ustálenej gélovej filtrácie, ktorá je pomerne jednoduchšia.
Čo je afinitná chromatografia?
Afinitná chromatografia je analytická technika a separačná metóda, ktorá závisí od špecifickej väzbovej interakcie medzi imobilizovaným ligandom a jeho väzbovým partnerom. Niektoré príklady zahŕňajú väzbu protilátka-antigén, väzbu enzým-substrát a väzbu enzým-inhibítor. Preto má táto technika mnoho dôležitých aplikácií pri čistení nukleových kyselín, čistení proteínov z bunkových extraktov a čistení z krvi.
Pri tejto technike je najdôležitejšou vlastnosťou imobilizácia ligandu. Na to môžeme použiť rôzne materiály ako sú akryláty a silikagél. Je dôležité zabrániť stérickej interferencii cieľovej molekuly s ligandom. Okrem toho je inhibítor pripojený k pevnej fáze. Tento inhibítor nazývame spacer. Klasicky sa dištančná vložka skladá z uhľovodíkového reťazca.
Stacionárna fáza afinitnej chromatografie obsahuje jadro, spacer a ligand. Niekedy má tiež kovový ión, ktorý je spojený s ligandom. Najvýhodnejšou pevnou fázou pre stacionárnu fázu pri tejto technike je agarózový gél, pretože sa ľahko dávkuje na naplnenie a naplnenie kolóny živicovými lôžkami akejkoľvek veľkosti a je dostatočne veľká na to, aby biomolekuly voľne prúdili do guľôčok a cez nich. Ligandy sa môžu kovalentne viazať na guľôčkový polymér rôznymi spôsobmi. Najbežnejšie spacerové zlúčeniny sú brómkyán, epoxid, epoxid s C6 kyselinou a diamín. Na druhej strane, ligand, ktorý môžeme použiť, sa líši podľa cieľa, napr. protilátka-antigén, ióny železa alebo hliníka-fosfoproteíny, avidín-biotín, glutatión-GST, proteíny označené chelátorom-His atď.
Aký je rozdiel medzi gélovou filtráciou a afinitnou chromatografiou?
Chromatografia je dôležitá analytická technika. Gélová filtračná chromatografia a afinitná chromatografia sú dve dôležité variácie chromatografie. Kľúčový rozdiel medzi gélovou filtráciou a afinitnou chromatografiou je v tom, že gélová filtračná chromatografia závisí od rozdielov v molekulovej hmotnosti alebo veľkosti vzorky analytu, zatiaľ čo afinitná chromatografia závisí od afinity analytu k imobilizovanému ligandu.
Zhrnutie – Gélová filtrácia vs afinitná chromatografia
Existujú rôzne typy chromatografických techník podľa ich použitia a povahy vzorky analytu. Gélová filtrácia a afinitná chromatografia sú dva takéto typy techník. Kľúčový rozdiel medzi gélovou filtráciou a afinitnou chromatografiou je ten, že gélová filtračná chromatografia závisí od rozdielov v molekulovej hmotnosti alebo veľkosti vzorky analytu, zatiaľ čo afinitná chromatografia závisí od afinity analytu k imobilizovanému ligandu.
