Kľúčový rozdiel – papierová verzus tenkovrstvová verzus stĺpcová chromatografia
Papierová chromatografia, tenkovrstvová chromatografia a stĺpcová chromatografia sú tri typy chromatografických techník. Kľúčový rozdiel medzi papierovou chromatografiou, chromatografiou na tenkej vrstve a stĺpcovou chromatografiou je založený na type stacionárnej fázy použitej v chromatografickej technike. Papierová chromatografia využíva celulózový papier ako svoju stacionárnu fázu, chromatografia na tenkej vrstve používa ako stacionárnu fázu oxid hlinitý alebo silikagél, zatiaľ čo kolónová chromatografia používa ako stacionárnu fázu kolónu naplnenú vhodným matricovým materiálom.
V procese separácie a identifikácie biomolekúl, ako sú bielkoviny a sacharidy, je dôležitou biofyzikálnou technikou chromatografia. Chromatografia oddeľuje zlúčeniny na základe ich rozpustnosti, veľkosti a náboja. Chromatografia založená na separačnom mechanizme využíva mechanizmy ako iónová výmena, absorpcia, rozdelenie a vylúčenie veľkosti a existujú tri chromatografické techniky; menovite papierová, tenkovrstvová a stĺpcová chromatografia. Papierová chromatografia je založená na adsorpcii tuhá látka-kvapalina a rozpustnosti zlúčeniny a ako stacionárna fáza používa celulózový papier. Chromatografia na tenkej vrstve je založená na adsorpcii molekúl tuhá látka-kvapalina. Má stacionárnu fázu, ktorá je typicky vyrobená z oxidu hlinitého alebo silikagélu, a mobilnú fázu, ktorá je rozpúšťadlom. Kolónová chromatografia využíva kolónu naplnenú matricou, ktorá sa používa na separáciu molekúl hlavne na základe ich veľkosti, afinity alebo jej náboja.
Čo je papierová chromatografia?
Papierová chromatografia je najjednoduchší typ používanej chromatografie a nepoužíva sa na rozsiahly výskum. Používa sa hlavne v študentských laboratóriách na identifikáciu biomolekúl, ako sú aminokyseliny a sacharidy prítomné v zmesiach. Papierová chromatografia využíva stacionárnu fázu, ktorá sa vyrába pomocou celulózového papiera alebo filtračného papiera Whatman, a mobilnú fázu, ktorá sa zvyčajne pripravuje pomocou organických rozpúšťadiel, ako je n-butanol atď. Stacionárna fáza je nasýtená vodou, čím sa stacionárna fáza stáva tekutou. Keď sa teda zlúčeniny nanesú na škvrny a nechajú sa bežať v prítomnosti mobilnej fázy, v závislosti od rozpustnosti zlúčenín sa oddelia. Po vytvorení chromatogramu sa teda môže vykonať farbenie, aby sa určila dĺžka každej zlúčeniny. Tým je možné vypočítať retenčný faktor.
Obrázok 01: Papierová chromatografia
Papierová chromatografia môže byť ďalej klasifikovaná ako vzostupná papierová chromatografia a zostupná papierová chromatografia v závislosti od smeru tečúceho rozpúšťadla.
Čo je tenkovrstvová chromatografia?
Chromatografia na tenkej vrstve alebo TLC je bežne používaná technika na identifikáciu rôznych aminokyselín prítomných v zmesi alebo na identifikáciu proteínov. Technika separácie je založená na adsorpcii tuhá látka-kvapalina. Pri chromatografii na tenkej vrstve sa ako stacionárna fáza používa platňa vyrobená z oxidu hlinitého alebo silikagélu. Zmes rozpúšťadiel sa mení podľa požiadavky a na prípravu rozpúšťadla môže používať rôzne kombinácie organických zlúčenín, ako je n-butanol, kyselina octová a voda. Zlúčeniny, ktoré sa majú oddeliť, sa nanesú na platňu a ponoria sa do zmesi rozpúšťadiel. Akonáhle sa rozpúšťadlo pohybuje nahor na základe kapilárneho účinku daného platňou, zlúčeniny nanesené na platni sa tiež pohybujú v závislosti od ich rozpustnosti v rozpúšťadle.
Obrázok 02: Chromatografia na tenkej vrstve
Detekcia škvŕn po chromatograme sa vykonáva rôznymi postupmi farbenia. Niektorí používajú farbenie ninhydrínom, čo je dosť toxická metóda farbenia. Moderné tenkovrstvové chromatogramy používajú fluorescenčné techniky na zobrazenie chromatogramu po cykle. V závislosti od prejdenej vzdialenosti je možné vypočítať retenčný čas každej zlúčeniny. Toto možno použiť na identifikáciu typu separovanej zlúčeniny na základe použitej zmesi. TLC sa používa hlavne na identifikáciu aminokyselín v proteínovej zmesi a tiež na oddelenie rôznych typov monosacharidov prítomných v zmesi.
Čo je stĺpcová chromatografia?
Stĺpcová chromatografia je široký pojem, ktorý sa používa na opis mnohých typov chromatografických techník, ktoré využívajú separačnú metódu založenú na kolóne. Pri stĺpcovej chromatografii sa na oddelenie zlúčenín používa fyzikálna kolóna s náplňou. Separácia môže byť založená na rôznych fyzikálnych vlastnostiach zlúčenín. Týmito vlastnosťami môžu byť náboj, veľkosť, 3D konformácia a väzbová kapacita atď. Kolóna naplnená matricovým materiálom teda pôsobí ako stacionárna fáza a premývací pufor aplikovaný na kolónu pôsobí ako mobilná fáza.
Ak sú molekuly oddelené na základe veľkosti, obalový materiál je zabalený tak, že zanecháva póry, ktorými môžu zlúčeniny prechádzať. Väčšie molekuly, ktoré nemôžu pretekať cez póry, sa teda eluujú ako prvé, kým menším molekulám trvá eluovanie oveľa dlhšie.
Obrázok 03: Stĺpcová chromatografia
Ak sú molekuly oddelené na základe ich náboja, stacionárna fáza bude obsahovať buď aniónový alebo katexový menič, ku ktorému budú zlúčeniny priťahované na základe ich náboja. Počas premývacieho kroku sa teda neviazané zlúčeniny budú eluovať. Po pridaní elučného pufra budú naviazané nabité zlúčeniny eluované. Detekcia týchto eluentov je väčšinou založená na spektrofotometrických technikách.
Aké sú podobnosti medzi tenkovrstvovou papierovou a stĺpcovou chromatografiou?
- Všetky tri techniky papierovej tenkovrstvovej a stĺpcovej chromatografie sa používajú na separáciu biomolekúl, ako sú aminokyseliny, bielkoviny a sacharidy.
- Techniky papierovej tenkovrstvovej a kolónovej chromatografie majú mobilnú fázu a stacionárnu fázu.
- Techniky papierovej tenkovrstvovej a kolónovej chromatografie využívajú biofyzikálne mechanizmy na separáciu.
Aký je rozdiel medzi tenkovrstvovou papierovou a stĺpcovou chromatografiou?
Papier vs tenkovrstvová vs stĺpcová chromatografia |
|
| Papierová chromatografia | Papierová chromatografia je chromatografická technika používaná na separáciu zlúčenín na základe adsorpcie kvapalina-kvapalina a rozpustnosti zlúčeniny. Ako svoju stacionárnu fázu používa celulózový papier. |
| Chromatografia na tenkej vrstve | Chromatografia na tenkej vrstve je ďalšou chromatografickou technikou založenou na adsorpcii molekúl tuhá látka-kvapalina. Má stacionárnu fázu vyrobenú z oxidu hlinitého alebo silikagélu a rozpúšťadlo ako mobilnú fázu, ktorým je rozpúšťadlo. |
| Stĺpcová chromatografia | Stĺpcová chromatografia využíva kolónu naplnenú matricou, ktorá sa používa na separáciu molekúl najmä na základe ich veľkosti, afinity alebo jej náboja. |
| Stacionárna fáza | |
| Papierová chromatografia | Papier vyrobený z nitrocelulózy od Whatman sa používa ako stacionárna fáza v papierovej chromatografii. |
| Chromatografia na tenkej vrstve | Alumina alebo silikagél sa používa ako stacionárna fáza tenkovrstvovej chromatografie. |
| Stĺpcová chromatografia | Stĺpec naplnený vhodným výplňovým materiálom sa používa ako stacionárna fáza v stĺpcovej chromatografii. |
| Mobilná fáza | |
| Papierová chromatografia | Prebiehajúce rozpúšťadlo je mobilná fáza papierovej chromatografie. |
| Chromatografia na tenkej vrstve | Prebiehajúce rozpúšťadlo je mobilná fáza tenkovrstvovej chromatografie. |
| Stĺpcová chromatografia | Premývací pufor je mobilná fáza kolónovej chromatografie. |
| Mechanizmy používané na oddelenie | |
| Papierová chromatografia | Papierová chromatografia je založená na absorpcii tuhá látka-kvapalina. |
| Chromatografia na tenkej vrstve | chromatografia na tenkej vrstve je založená na absorpcii tuhá látka-kvapalina. |
| Stĺpcová chromatografia | Stĺpcová chromatografia je založená na vylúčení veľkosti, náboja a tvaru. |
| Elution Buffer | |
| Papierová chromatografia | Nevyžaduje sa papierovou chromatografiou. |
| Chromatografia na tenkej vrstve | Nevyžaduje sa pre tenkovrstvovú chromatografiu. |
| Stĺpcová chromatografia | Vyžaduje sa pri stĺpcovej chromatografii. |
| Detekcia | |
| Papierová chromatografia | Sfarbenie a stanovením retenčného faktora. |
| Chromatografia na tenkej vrstve | Sfarbenie a stanovením retenčného faktora. |
| Stĺpcová chromatografia | Spektrofotometrické stanovenie. |
Súhrn – tenkovrstvová papierová verzus stĺpcová chromatografia
Papierová chromatografia, TLC a stĺpcová chromatografia sú separačné techniky používané na separáciu biomolekúl, ako sú proteíny, aminokyseliny a sacharidy (hlavne monosacharidy). Papierová chromatografia využíva celulózový papier ako stacionárnu fázu a mechanizmus separácie je založený na adsorpcii tuhá látka-kvapalina. TLC využíva aj adsorpčné mechanizmy tuhá látka-kvapalina. Molekuly sa separujú na stacionárnej fáze v závislosti od ich rozpustnosti v mobilnej fáze. Kolónová chromatografia využíva na separáciu fyzikálne vlastnosti, ako je veľkosť, tvar, náboj a molekulová hmotnosť zlúčeniny. Kolóna naplnená matricovým materiálom pôsobí ako stacionárna fáza, zatiaľ čo premývací pufor pôsobí ako rozpúšťadlová fáza. Toto je rozdiel medzi tenkou vrstvou papiera a stĺpcovou chromatografiou.
