Kľúčový rozdiel medzi klonovaním pomocou klonovania a sekvenovaním brokovnicou spočíva v ich spôsobe správania. Metóda klonovania pomocou klonovania zahŕňa mapovanie chromozómov a klonovanie pred sekvenovaním, zatiaľ čo klonovanie pomocou brokovnice vynecháva počas sekvenovania kroky mapovania chromozómov aj klonovania.
Klonovanie pomocou klonovania a klonovanie pomocou brokovnice sú dve metódy moderného sekvenovania genómu. Spoľahlivejšou metódou sekvenovania je klonovanie klonovaním. Metóda klonovania brokovnicovým sekvenovaním je však rýchlejšia a lacnejšia. Článok sa zameriava na jemný rozdiel medzi klonovaním pomocou klonovania a sekvenovaním pomocou brokovnice.
Čo je klonovanie pomocou klonovania?
Klonovanie pomocou klonovania je metóda sekvenovania genómu. Vyžaduje mapovanie každého chromozómu pred rozdelením DNA. Po mapovaní by sa DNA mala rozložiť na fragmenty dlhé 150 kilobáz. Tieto fragmenty sú potom pripravené na sekvenovanie. Ďalším krokom je vloženie fragmentov DNA do bakteriálnych umelých chromozómov (BAC) a potom do bakteriálnych buniek. Keďže fragmenty sú teraz vo vnútri bakteriálnych buniek, zakaždým, keď sa baktérie delia, vložené fragmenty DNA sa tiež delia a vytvárajú mnoho identických kópií. Potom sa individuálny bakteriálny klon DNA fragmentuje na fragmenty dlhé 500 párov báz. Sú to menšie a prekrývajúce sa fragmenty. Ďalej sa uskutoční sekvenovanie s vložením týchto fragmentov do vektora so známou sekvenciou DNA. Počnúc od známej sekvencie vektora, sekvenovanie pokračuje až po neznámu sekvenciu.
Po dokončení sekvenovania je potrebné identifikovať oblasti prekrývajúcich sa sekvencií. Potom sa uskutoční spojenie fragmentov, aby sa vytvorili väčšie fragmenty pôvodne prítomné v BAC. Ďalej prebieha zostavenie väčších fragmentov do chromozómu podľa mapy genómu.
Obrázok 01: Klonovanie pomocou klonovania sekvencovania
Významnou výhodou klonovania pomocou sekvenovania klonov je, že vopred pripravená mapa genómu pomáha spoľahlivému zostaveniu väčších fragmentov. Nevýhodou tejto metódy sekvenovania je však to, že generovanie máp genómu a vytváranie klonov je časovo náročné. Toto však bola metóda preferovaná počas ‚Projektu ľudského genómu‘.
Čo je Clone by Shotgun Sequencing?
Sekvenovanie klonovaním pomocou brokovnice je sekvenačná metóda, ktorá náhodne rozdeľuje sekvencie DNA na mnoho malých fragmentov a znova zostavuje sekvenciu pozorovaním prekrývajúcich sa oblastí. Väčšie genómy cicavcov je ťažké klonovať a zostaviť. Je to kvôli ich konštrukčnej zložitosti a veľkosti. Aj keď je metóda klonovania pomocou klonovania spoľahlivá, sekvenovanie genómov zložitých organizmov trvá dlho. Preto sa klonovanie pomocou brokovnice stalo spoľahlivou lacnejšou sekvenčnou metódou, ktorú je možné vykonávať rýchlejšie. Preto sa moderní vedci spoliehajú na túto metódu sekvenovania pri riešení zložitých genómov.
Obrázok 02: Klonovanie pomocou sekvenovania brokovnice
Počas klonovania metódou sekvenovania brokovnicou sa neuskutočňujú žiadne konvenčné kroky mapovania genómu a klonovania. Spočiatku je celý genóm fragmentovaný na rôzne veľkosti od 20 kilobáz do 300 kilobáz. Ďalej sa uskutoční sekvenovanie. Potom pomocou sofistikovaného počítačového softvéru je potrebné poskladať fragmenty pohľadom na prekrývajúce sa oblasti.
Klonovanie pomocou brokovnicového sekvenovania pomáha zlepšiť presnosť existujúcich sekvencií genómu. Hlavnou výhodou tejto metódy je, že je oveľa rýchlejšia a lacnejšia ako metóda klonovania pomocou klonovania. Tento proces však nezahŕňa použitie genetickej mapy. Preto je pravdepodobnejšie, že sa počas montáže vyskytnú chyby. Toto je teda hlavná nevýhoda pri klonovaní metódou brokovnicového sekvenovania.
Aké sú podobnosti medzi klonovaním pomocou klonovania sekvenovaním a sekvenovaním brokovnicou?
- Sekvenovanie klonovaním klonovaním a sekvenovanie brokovnicou sú dve metódy sekvenovania genómu.
- Počas oboch techník sekvenovania prebieha zostavovanie rozložených fragmentov identifikáciou prekrývajúcich sa oblastí.
- Pre klonovanie aj sekvenovanie pomocou brokovnice je tiež potrebný rozklad DNA na menšie fragmenty.
Aký je rozdiel medzi klonovaním pomocou klonovania sekvenovaním a sekvenovaním brokovníc?
Sekvenčná technika klonovania klonom zahŕňa dva hlavné kroky: mapovanie chromozómov a klonovanie. Na rozdiel od toho, klonovanie pomocou brokovnice nesleduje tieto dva kroky; náhodne rozbije sekvencie DNA na mnoho malých fragmentov a znova zostaví sekvenciu pozorovaním prekrývajúcich sa oblastí. Toto je teda kľúčový rozdiel medzi klonovaním klonovaním sekvenovaním a sekvenovaním brokovnicou. Kvôli tomuto faktoru je klonovanie po klonovaní drahým a časovo náročným procesom, zatiaľ čo sekvenovanie klonovaním pomocou brokovnice je rýchlejšie a lacnejšie.
Chyby počas zostavovania sú však menej pravdepodobné, že sa vyskytnú počas klonovania pomocou sekvenovania klonov. Preto má vysokú spoľahlivosť. Klonovanie pomocou brokovnice je však pomerne menej spoľahlivá technika. Toto je tiež významný rozdiel medzi klonovaním klonovaním sekvenovaním a sekvenovaním brokovnicou.
Informačná grafika uvedená nižšie predstavuje viac informácií týkajúcich sa rozdielu medzi klonovaním pomocou klonovania a sekvenovaním brokovnicou.
Zhrnutie – Klonovanie pomocou klonovania sekvenovania vs sekvenovanie brokovníc
Pri zhrnutí rozdielu medzi klonovaním klonovaním sekvenovaním a sekvenovaním pomocou brokovnice, klonovanie klonovaním a sekvenovanie brokovnicou sú dve metódy sekvenovania genómu. Technika klonovania pomocou klonovania však zahŕňa procesy mapovania genómu aj klonovania, zatiaľ čo klonovanie pomocou brokovnice nie. Toto je kľúčový rozdiel medzi klonovaním pomocou klonovania a sekvenovaním brokovnicou. Pretože mapovanie genómu prebieha počas klonovania sekvenovaním klonov, je menej pravdepodobné, že sa vyskytnú chyby počas zostavovania sekvencií. Ale klonovanie pomocou brokovnice je oveľa rýchlejší a lacnejší proces. Napriek tomu je pomerne menej spoľahlivý. Sekvenovanie klonov po klonoch bolo preferovanou metódou sekvenovania počas „Projektu ľudského genómu“. Moderný molekulárny biológ sa však viac spolieha na klonovanie pomocou brokovnice.
