Kľúčový rozdiel – PCR vs sekvenovanie DNA
PCR a sekvenovanie DNA sú dve dôležité techniky v molekulárnej biológii. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je proces, ktorý vytvára veľké množstvo kópií fragmentu DNA. Sekvenovanie DNA je technika, ktorej výsledkom je presné poradie nukleotidov daného fragmentu DNA. Toto je kľúčový rozdiel medzi PCR a sekvenovaním DNA. PCR je jedným z hlavných krokov zahrnutých v sekvenovaní DNA.
Čo je to PCR?
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je technika amplifikácie DNA používaná v molekulárnej biológii. Vytvára tisíce až milióny kópií konkrétneho fragmentu DNA. Túto metódu vyvinul Kary Mullis v roku 1983. V tejto technike fragment DNA, ktorý sa má amplifikovať, slúži ako templát a enzým DNA polymeráza pridáva komplementárne nukleotidy k priméru, ktorý je dostupný v zmesi PCR. Na konci PCR reakcie sa syntetizuje veľa kópií vzorky DNA.
Sú rôzne zložky PCR zmesi, vrátane DNA, DNA polymerázy (Taq polymeráza), primérov (priamych a reverzných primérov), nukleotidov (stavebných blokov DNA) a pufra. PCR prebieha vo vnútri stroja PCR a do stroja by sa mala vložiť správna zmes PCR a mal by sa spustiť správny program. Táto technika umožňuje produkciu tisícok až miliónov kópií určitej časti DNA z veľmi malého množstva DNA.
Reakcie PCR prebiehajú cyklickým spôsobom a vytvárajú viditeľné množstvo produktov PCR na géli. Reakcia PCR zahŕňa tri hlavné kroky, a to denaturáciu, aneláciu primérov a predlžovanie reťazca, ako je znázornené na obrázku 01. Tieto tri kroky prebiehajú pri troch rôznych teplotách. DNA existuje v dvojvláknovej forme vodíkovými väzbami medzi komplementárnymi bázami. Pred implikáciou by sa dvojvláknová DNA mala od seba oddeliť. Robí sa tak, že sa dáva vysoká teplota. Pri vysokej teplote sa dvojvláknová DNA denaturuje na jednotlivé vlákna. Potom by sa priméry mali priblížiť k priľahlým koncom špecifického fragmentu alebo génu DNA. Primér je krátky kúsok jednovláknovej DNA, ktorý je komplementárny k cieľovej sekvencii. Priamy a reverzný primér žíha s komplementárnymi bázami na lemujúcich koncoch denaturovanej vzorky DNA pri teplote žíhania. Základné nátery by mali byť odolné voči teplu. Akonáhle sa priméry anelujú so vzorkou DNA, enzým taq polymeráza iniciuje syntézu nových vlákien pridaním nukleotidov, ktoré sú komplementárne k cieľovej DNA. Taq polymeráza je tepelne stabilný enzým izolovaný z termofilnej baktérie nazývanej Thermus aquaticus. Pufer PCR udržuje optimálne podmienky pre pôsobenie taq polymerázy. Tieto tri stupne PCR reakcií sa opakujú, aby sa vytvorilo požadované množstvo produktu PCR. Po každej PCR reakcii sa počet kópií DNA zdvojnásobí. V PCR je teda možné pozorovať exponenciálnu amplifikáciu. Produkty PCR možno pozorovať pomocou gélovej elektroforézy a možno ich pre ďalšie štúdie purifikovať.
Obrázok 01: Hlavné kroky PCR reakcie
PCR je cenným nástrojom v lekárskom a biologickom výskume. PCR má osobitnú hodnotu vo forenznej vede, pretože môže amplifikovať DNA pre štúdie z malých vzoriek od zločincov a vytvárať forenzné profily DNA. PCR sa široko používa v mnohých oblastiach molekulárnej biológie vrátane genotypizácie, klonovania génov, detekcie mutácií, sekvenovania DNA, mikročipov DNA a testovania otcovstva atď.
Obrázok 02: Polymerázová reťazová reakcia
Čo je sekvenovanie DNA?
Sekvenovanie DNA je určenie presného poradia nukleotidov – adenínu, guanínu, cytozínu a tymínu v danom fragmente DNA. Genetická informácia je uložená v sekvenciách DNA pomocou správneho poradia nukleotidov. Preto je veľmi dôležité nájsť presné poradie nukleotidov vo fragmente DNA, aby ste vedeli o štruktúre a funkcii génov.
Sekvenčný protokol DNA zahŕňa rôzne procesy. Prvým krokom je izolácia zainteresovanej DNA alebo genómovej DNA organizmu. Pomocou PCR (ako je opísané vyššie) by sa mala amplifikovať požadovaná oblasť DNA. Amplifikovaný produkt PCR by mal byť oddelený gélovou elektroforézou a purifikovaný. Amplifikované fragmenty slúžia ako templáty na sekvenovanie. Sekvenovanie sa môže uskutočniť buď podľa Sangerovho sekvenovania alebo vysokovýkonnej sekvenčnej metódy. Sangerove sekvenovanie vyžaduje kapilárnu elektroforézu výsledných fragmentov DNA. Určenie správneho poradia nukleotidov je možné vykonať manuálnym čítaním autorádiografov alebo použitím automatických sekvenátorov DNA.
Génové sekvenovanie prispelo k projektu Ľudský genóm a uľahčilo mapovanie ľudského genómu v roku 2003. Vo forenznej oblasti umožnilo sekvenovanie DNA identifikovať jednotlivcov, ktorí vykazujú jedinečné sekvencie DNA, a identifikovať zločincov. V medicíne možno sekvenovanie DNA použiť na detekciu génov zodpovedných za genetické a iné choroby, nájdenie defektných génov a ich nahradenie správnymi génmi. V poľnohospodárstve sa informácie o sekvenovaní DNA niektorých mikroorganizmov používajú na produkciu transgénnych plodín s ekonomicky požadovanými vlastnosťami.
Obrázok 03: Sekvenovanie DNA
Aký je rozdiel medzi PCR a sekvenovaním DNA?
PCR vs sekvenovanie DNA |
|
| Proces PCR vytvára tisíce až milióny kópií zainteresovaného fragmentu DNA. | Sekvenovanie DNA je proces určenia presného poradia nukleotidov v danom fragmente DNA. |
| Výsledok | |
| PCR vytvára tisíce až milióny kópií konkrétneho fragmentu DNA | Výsledkom je správne poradie báz v konkrétnom fragmente DNA. |
| Zapojenie ddNTPs | |
| PCR nevyžaduje ddNTP. Používa dNTPs. | Sekvenovanie DNA vyžaduje ddNTP na ukončenie tvorby vlákna. |
Zhrnutie – PCR vs sekvenovanie DNA
PCR a sekvenovanie DNA sú veľmi dôležité nástroje v mnohých oblastiach molekulárnej biológie. Amplifikácia fragmentov DNA sa uskutočňuje technikou PCR, pričom správne poradie nukleotidov fragmentu DNA sa určuje sekvenovaním DNA. Toto je rozdiel medzi PCR a sekvenovaním DNA.
