Kľúčový rozdiel – Forward a Reverse Primer
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je metóda amplifikácie DNA, ktorá sa používa v aplikáciách molekulárnej biológie. Je to bežne používaná technika, ktorá vytvára milióny až miliardy kópií mimoriadne zaujímavej sekvencie DNA. Ide o metódu in vitro vykonávanú v laboratóriách. Technika PCR je úplne závislá od komerčne vyrábanej DNA polymerázy nazývanej Taq polymeráza. A tiež vyžaduje niekoľko ďalších komponentov a správne udržiavanie teploty. Jednou z dôležitých zložiek sú primery. Priméry sú krátke sekvencie DNA špecificky navrhnuté pre cieľovú sekvenciu DNA. Zvyčajne majú dĺžku okolo 20 nukleotidov. Taq polymeráza katalyzuje pridávanie nukleotidov do už existujúcej nukleotidovej sekvencie. Priméry teda slúžia ako východiskové body syntézy nových vlákien. Taq polymeráza funguje iba v smere 5' až 3', takže syntéza DNA prebieha v rovnakom smere 5' až 3'. Pretože DNA je dvojvláknová, pri PCR sú potrebné dva typy primérov. Sú známe ako priamy primér a spätný primér. Dopredné a spätné priméry sa označujú na základe smeru predĺženia priméru v DNA, keď nastáva syntéza DNA. Dopredný primér aneluje s antisense reťazcom DNA a iniciuje syntézu kladného reťazca génu v smere od 5' do 3'. Reverzný primér aneluje so sense vláknom a iniciuje syntézu komplementárneho vlákna kódujúceho vlákna; čo je -ve reťazec génu v smere od 5' do 3'. Toto je kľúčový rozdiel medzi priamymi a spätnými primérmi.
Čo je to Forward Primer?
Dopredná orientácia je syntéza kódujúceho reťazca alebo sense vlákna génu. Taq polymeráza katalyzuje syntézu nového vlákna v smere 5' až 3'. K syntéze kódujúceho vlákna dochádza, keď sa primér aneluje s nekódujúcim alebo antisense vláknom a predlžuje sa v smere 5' až 3'.
Obrázok 01: Dopredné a spätné primery
Primér, ktorý aneluje s antisense reťazcom alebo nekódujúcim reťazcom alebo templátovým reťazcom, je známy ako priamy primér, pretože priamy primér pôsobí ako východiskový bod syntézy kódujúceho alebo pozitívneho reťazca génu. Dopredný primér má krátku nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k 3' lemujúcemu koncu antisense vlákna. Hybridizuje s antisense vláknom a uľahčuje Taq polymeráze pridanie nukleotidov, ktoré sú komplementárne k templátovému vláknu.
Čo je reverzný základný náter?
Reverzný primér je krátka sekvencia DNA, ktorá aneluje s 3' koncom sense vlákna alebo kódujúceho vlákna. Reverzný primér slúži ako východiskový bod na syntézu komplementárneho vlákna kódujúcej sekvencie alebo nekódujúcej sekvencie. Reverzný primér je navrhnutý ako komplementárny k 3' koncu kódujúceho vlákna. Preto žíha s lemujúcim 3' koncom kódujúceho vlákna a umožňuje Taq polymeráze syntetizovať antisense vlákno alebo templátové vlákno. Keďže jeho orientácia je obrátená, tento primer je označený ako reverzný primer.
Reverzné aj dopredné priméry sú dôležité pre produkciu miliónov až miliárd kópií konkrétnych oblastí DNA, ktoré sú cielené alebo o ktoré majú záujem.
Aké sú podobnosti medzi priamym a spätným primerom?
- Dopredné aj spätné priméry sú vyrobené z oligonukleotidov.
- Dopredné aj reverzné priméry majú krátku nukleotidovú sekvenciu komplementárnu k priľahlým koncom dvojvlákna DNA.
- Dopredné aj spätné priméry zvyčajne pozostávajú z 20 nukleotidov.
- Pri polymerázových reťazových reakciách sa používajú dopredné aj spätné priméry.
- Dopredné aj spätné priméry sa syntetizujú komerčne.
- Priméry Forward aj Reverse sú teplotne stabilné a zvyčajne majú podobnú Tm.
- Dopredné aj spätné priméry sú spojené s cieľovými sekvenciami DNA.
- Dopredné aj spätné priméry sú navrhnuté podľa reakcií PCR.
- Dopredné aj spätné priméry slúžia ako východiskové body pre amplifikáciu DNA.
- Reverzné aj dopredné priméry sú dôležité pre produkciu miliónov kópií konkrétnych oblastí cieľových alebo zainteresovaných sekvencií DNA.
Aký je rozdiel medzi dopredným a spätným primerom?
Dopredný primer vs spätný primer |
|
| Dopredný primér je krátka sekvencia DNA, ktorá hybridizuje s 3' koncom nekódujúceho alebo templátového reťazca génu a slúži ako východiskový bod na syntézu kódujúcej sekvencie. | Reverzný primér je krátka sekvencia DNA, ktorá hybridizuje s 3' koncom kódujúceho alebo netemplátového reťazca a slúži ako východiskový bod na syntézu nekódujúcej sekvencie. |
| Žíhacie vlákno | |
| Dopredný primer žíha so šablónovým vláknom. | Reverzný primer žíha s vláknom bez šablóny. |
| Výsledná nová sekvencia | |
| Dopredný primér uľahčuje syntézu kódujúcej sekvencie. | Reverzný primér uľahčuje syntézu nekódujúcej sekvencie. |
Súhrn – Dopredný verzus Reverzný primer
V technike PCR sú zahrnuté dva typy primérov. Sú to dopredné a spätné priméry. Na základe predĺženia priméru pri syntéze nového reťazca DNA sú tieto priméry označené alebo pomenované. Taq polymeráza syntetizuje novú DNA v orientácii 5' až 3'. Preto sú priméry navrhnuté ako komplementárne k 3 'koncom dvojitých vlákien. Dopredný primér, ktorý sa predlžuje v smere 5' až 3', hybridizuje s 3' koncom antisense alebo templátu alebo nekódujúcej sekvencie. Slúži ako východiskový bod pre syntézu kódujúcej sekvencie. Reverzný primér, ktorý sa predlžuje v smere 5' až 3', hybridizuje s 3' koncom kódujúceho alebo netemplátového alebo sense vlákna. Slúži ako východiskový bod pre syntézu nekódujúcej sekvencie. Toto je rozdiel medzi dopredným a spätným primérom.
