Kľúčový rozdiel – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotidy sú základné štrukturálne jednotky a stavebné kamene DNA. Molekula DNA sa skladá z polynukleotidového reťazca. V DNA sa nachádzajú štyri rôzne nukleotidy. Tieto nukleotidy sa skladajú zo štyroch rôznych dusíkatých báz s názvom A (adenín), G (guanín), C (cytozín), T (tymín). Poradie nukleotidov v molekule DNA má veľký význam, pretože kóduje dôležitú genetickú informáciu pre rast a vývoj organizmov. Sekvenovanie DNA sa týka procesu, ktorý určuje presnú nukleotidovú sekvenciu DNA. Existujú rôzne metódy sekvenovania DNA. Sekvenovanie Maxam Gilbert a sekvenovanie Sangerovej DNA sú dve metódy sekvenovania DNA, ktoré patria do sekvenovania prvej generácie. Sekvenčný postup Maxam Gilbert určuje sekvenciu báz chemickým štiepením fragmentov DNA označených na 5' konci prednostne na každom zo štyroch nukleotidov a gélovou elektroforézou. Postup Sangerovho sekvenovania určuje nukleotidovú sekvenciu syntetizovaním jednovláknovej DNA pomocou DNA polymerázy a dideoxynukleotidov a gélovej elektroforézy. Toto je kľúčový rozdiel medzi Maxam Gilbert a Sanger Sequencing.
Čo je sekvenovanie Maxama Gilberta?
Sekvenovanie Maxama Gilberta, tiež známe ako metóda chemického sekvenovania, je technika, ktorá bola vyvinutá na určenie poradia nukleotidov v DNA. Túto metódu zaviedli W alter Gilbert a Alan Maxam v roku 1976 a stala sa populárnou, pretože ju možno vykonať priamo s purifikovanou DNA. Metóda Maxama Gilberta patrí k prvej generácii sekvenovania DNA a bola to prvá metóda sekvenovania široko používaná vedcami.
Základný princíp tejto metódy spočíva v obmedzení koncovo značených fragmentov DNA na špecifických bázach chemikáliami a podmienkami špecifickými pre bázu a separácii značených fragmentov elektroforézou, ako je znázornené na obrázku 01. Fragmenty sa oddeľujú podľa na ich veľkosti na géli. Keďže fragmenty sú označené, sekvenciu molekuly DNA možno ľahko odvodiť.
Maxam gilbert metóda používa základné chemikálie na rozbitie DNA na špecifických bázach. Na selektívne napadnutie purínov a pyrimidínov sa používajú dve bežné chemikálie nazývané dimetylsulfát a hydrazín.
Sekvenčná metóda Maxam Gilbert sa vykonáva v niekoľkých krokoch takto.
- Purifikácia sekvencie DNA pomocou reštrikčných endonukleáz
- Značenie koncov fragmentov DNA pridaním rádioaktívnych fosfátov
- Čistenie značených fragmentov od neznačených fragmentov gélovou elektroforézou
- Separácia koncovej značenej DNA do štyroch skúmaviek a oddelené ošetrenie chemikáliami špecifickými pre bázu
- Elektroforéza obsahu každej skúmavky na samostatných linkách na géli a separácia fragmentov podľa ich dĺžky.
- Detekcia fragmentov autorádiografom.
Obrázok 01: Sekvenovanie Maxama Gilberta
Čo je Sangerovo sekvenovanie?
Sangerove sekvenovanie je metóda sekvenovania vyvinutá Frederickom Sangerom a jeho kolegami v roku 1977 na určenie sekvencie báz daného fragmentu DNA. Je tiež známa ako sekvenovanie ukončenia reťazca alebo metóda Dideoxy sekvenovania. Táto metóda funguje na princípe selektívneho začlenenia dideoxynukleotidov ukončujúcich reťazec (ddNTP), ako sú ddGTP, ddCTP, ddATP a ddTTP, pomocou DNA polymerázy počas syntézy jednovláknovej DNA na ukončenie tvorby vlákna. Dideoxynukleotidom chýbajú 3'OH skupiny na tvorbu fosfodiesterových väzieb so susedným nukleotidom. Tvorba vlákna sa teda zastaví, keď sa ddNTP začlení do novotvoriaceho sa vlákna počas Sangerovho sekvenovania.
Pri tejto metóde sa uskutočňujú štyri samostatné reakcie syntézy DNA (PCR) v štyroch samostatných skúmavkách s jedným typom ddNTP. Ďalšie požiadavky sú dodávané aj pre skúmavky pre PCR vrátane primérov, dNTP, Taq polymerázy, špecifických podmienok atď. Vykonajú sa štyri samostatné reakcie v štyroch skúmavkách so štyrmi zmesami. Po PCR reakciách sú výsledné fragmenty DNA tepelne denaturované a oddelené gélovou elektroforézou. Potom sa fragmenty vizualizujú pomocou buď značeného (rádioaktívneho alebo fluorescenčného) primeru alebo dNTP, ako je znázornené na obrázku 02.
Obrázok 02: Sangerovo sekvenovanie
Aký je rozdiel medzi Maxam Gilbert a Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Sekvenovanie Maxama Gilberta je prvá technika vyvinutá na sekvenovanie DNA. | Sangerova sekvenačná metóda bola zavedená po sekvenačnej metóde Maxama Gilberta. |
| Použitie | |
| Táto metóda sa používa zriedka. | Sangerovo sekvenovanie sa bežne používa na sekvenovanie. |
| Používanie nebezpečných chemikálií | |
| Používa nebezpečné chemikálie. | Používanie nebezpečných chemikálií je v porovnaní s metódou Maxama Gilberta obmedzené. |
| Označenie na zistenie | |
| Táto metóda používa rádioaktívne P32 na označenie koncov fragmentov DNA. | Sangerove sekvenovanie využíva rádioaktívne alebo fluorescenčne označené ddNTP. |
Zhrnutie – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Sekvenovanie Maxama Gilberta a Sangera sú dva typy techník sekvenovania DNA, ktoré patria do sekvenovania DNA prvej generácie. Sekvenovanie podľa Maxama Gilberta je prvá metóda zavedená na sekvenovanie DNA v roku 1976 a vykonáva sa rozbitím koncových fragmentov DNA chemikáliami špecifickými pre bázu. Preto je známe ako chemické sekvenovanie. Metóda Sangerovho sekvenovania bola zavedená v roku 1977 a je založená na reakciách ukončenia reťazca riadených ddNTP. Sangerova metóda sekvenovania je obľúbenejšia ako metóda Maxama Gilberta kvôli niekoľkým nevýhodám metódy Maxam Gilbert, ako je nadmerná časová náročnosť, používanie nebezpečných chemikálií atď. Toto je rozdiel medzi sekvenovaním Maxama Gilberta a Sangera.
