Kľúčový rozdiel – klonovanie verzus subklonovanie
Klonovanie a subklonovanie sú molekulárne biologické postupy, ktoré vytvárajú geneticky identické bunky alebo organizmy nesúce DNA alebo gén, ktorý je predmetom záujmu. Klonovanie je technika, ktorá zahŕňa vloženie zainteresovaného génu alebo DNA do vektora, jeho replikáciu v hostiteľskej baktérii a produkciu buniek alebo organizmov, ktoré sú presnými kópiami genetického zloženia. Subklonovanie je technika, ktorá zahŕňa vloženie požadovaného génu, ktorý je už vložený do vektora, do sekundárneho vektora, jeho replikáciu v hostiteľskej baktérii a produkciu geneticky identických kópií buniek alebo organizmov. Kľúčový rozdiel medzi klonovaním a subklonovaním je v tom, že pri klonovaní požadovaný gén po ligácii do vektora pokračuje v procese klonovania, zatiaľ čo pri subklonovaní sa už klonovaný požadovaný gén oddelí od rodičovského vektora a znova sa vloží do vektor príjemcu a pokračujte v procese.
Čo je klonovanie?
Klonovanie je postup, pri ktorom vznikajú geneticky identické organizmy alebo bunky. V prírode sa klonovanie deje spôsobom nepohlavného rozmnožovania. Keď nedôjde k genetickej rekombinácii alebo zmene, dcérske bunky dostávajú rovnakú genetickú výbavu ako rodičia. Prokaryotické a eukaryotické organizmy vytvárajú klony binárnym štiepením, pučaním, mitózou atď. V molekulárnej biológii je klonovanie génov alebo špecifických fragmentov DNA populárnou metódou na štúdium štruktúry a funkcie daného úseku DNA.
Hlavným cieľom molekulárneho klonovania je vytvoriť milióny kópií geneticky identických buniek alebo organizmov nesúcich požadovaný fragment DNA (hlavne gény). Vytvára organizmy s presnými genetickými kópiami iného. Primárne sa špecifické gény klonujú v molekulárnych štúdiách na získanie štruktúrnych a funkčných informácií a na sekvenovanie DNA. Na produkciu špecifických proteínov alebo produktov vo veľkom meradle sa tiež široko používa klonovanie.
Postup klonovania
Základné kroky postupu klonovania sú nasledovné.
- Identifikácia a izolácia génu záujmu. (Amplifikácia požadovaného génu pomocou PCR).
- Reštrikčné štiepenie požadovaného génu (reštrikčná endonukleáza prerušila gén).
- Reštrikčné štiepenie vektorovej DNA. (Vektorová DNA sa tiež štiepi pomocou rovnakej restrikčnej endonukleázy).
- Vloženie génu do vektora a vytvorenie rekombinantnej molekuly.
- Transformácia rekombinantného vektora na hostiteľskú baktériu.
- Izolácia a identifikácia transformovaných baktérií (plazmidový vektor by mal obsahovať selektovateľný gén, najčastejšie gén rezistencie na antibiotiká na skríning transformovaných baktérií).
- Rekombinantná génová expresia v hostiteľovi.
Figure_01: Postup klonovania
Čo je subklonovanie?
Subklonovanie je postup presunu požadovaného génu z jedného vektora do druhého, aby sa zistila expresia génu, aby sa získala požadovaná funkčnosť génu. V tejto metóde sú zahrnuté dva vektory; menovite rodičovský vektor a cieľový vektor. Klonované inzerty sa pri subklonovaní opäť presunú do druhého vektora. Cieľom prenosu génu z prvého vektora do druhého vektora je získať niečo, čo by nebolo možné uskutočniť prvým vektorom, alebo znovu oddeliť gén v už klonovanom fragmente DNA a exprimovať ho samotný. Na začiatku sa v tomto postupe používajú reštrikčné enzýmy.
Postup subklonovania
Základné kroky subklonovania sú nasledovné.
- Pomocou restrikčných endonukleáz separácia požadovanej DNA v donorovom plazmide (rodičovský vektor).
- Amplifikácia požadovanej DNA pomocou PCR.
- Purifikácia produktu PCR (požadovaná DNA) gélovou elektroforézou.
- Otvorenie recipientného plazmidu rovnakými reštrikčnými endonukleázami, aké sa používajú na separáciu záujmovej DNA v rodičovskom plazmide.
- Ligácia požadovanej DNA (génu) do plazmidu príjemcu, aby sa vytvoril subklonovaný plazmid.
- Transformácia subklonovaného vektora na kompetentnú hostiteľskú baktériu.
- Skríning transformovaných buniek.
- Prečistenie plazmidovej DNA a použitie na sekvenovanie DNA alebo expresiu génov na získanie požadovaných produktov.
Subklonovanie sa vykonáva pri príležitostiach izolácie jedného génu z klonovanej skupiny génov alebo keď je požadovaný gén preniesť do užitočného plazmidu, aby sa zistila presná funkcia požadovaného génu.
Obrázok_02: Postup subklonovania
Aký je rozdiel medzi klonovaním a subklonovaním?
Klonovanie verzus subklonovanie |
|
| Klonovanie je postup, pri ktorom vznikajú geneticky identické organizmy alebo bunky. | Subklonovanie je postup presunu požadovaného génu z jedného vektora do druhého, aby sa zistila expresia génu, aby sa získala požadovaná funkčnosť génu. |
| Proces | |
| Oddeľte požadovanú DNA z organizmu a raz vložte do vektora a naklonujte | Už klonovaná DNA je oddelená od prvého vektora a vložená do druhého vektora a klonovaná. |
| Vložiť pohyb cez vektory | |
| Nepresunie vložky (DNA záujmu) z jedného vektora do druhého. | Presuňte vložky z nadradeného vektora do cieľového vektora. |
Zhrnutie – Klonovanie verzus subklonovanie
Klonovanie vytvára geneticky identické bunky alebo organizmy s vloženým požadovaným génom alebo DNA. Prebieha separáciou a inzerciou DNA záujmu do vektora a expresiou v hostiteľskej baktérii. Subklonovanie zdieľa podobné kroky ako klonovanie. Pri subklonovaní sa však už klonovaný fragment DNA (požadovaný gén) vloží do vektora a transformuje sa do hostiteľskej baktérie. To je kľúčový rozdiel medzi klonovaním a subklonovaním.
