Kľúčový rozdiel – Gram Stain a Acid Fast
Baktérie sú veľmi malé mikroorganizmy. Sú priehľadné a ich odhalenie je ťažké v živých a nepoškvrnených podmienkach. Na uľahčenie detekcie baktérií sú teda vyvinuté rôzne metódy farbenia. Existujú tri hlavné typy techník farbenia: jednoduché farbenie, diferenciálne farbenie a štrukturálne farbenie. Diferenciálne farbenie je technika, ktorá používa viac ako jedno farbenie na rozlíšenie baktérií. Gramovo farbenie a kyselinostále farbenie sú najznámejšie ako diferenciálne škvrny. Gramovo farbenie je technika diferenciálneho farbenia, ktorá oddeľuje baktérie do dvoch skupín známych ako Gram-pozitívne baktérie a Gram-negatívne baktérie. Kyselinostále farbivo je rozdielne farbivo používané na identifikáciu kyslo‑stálych organizmov, ako je Mycobacterium, od nekyselinovzdorných organizmov. Toto je kľúčový rozdiel medzi farbením podľa Grama a farbením Acid Fast.
Čo je Gram Stain?
Gramove farbenie je dôležitá technika diferenciálneho farbenia používaná na identifikáciu baktérií v mikrobiológii. Túto techniku zaviedol dánsky bakteriológ Hans Christian Gram v roku 1884. Gramové farbenie kategorizuje baktérie do dvoch veľkých skupín nazývaných gram pozitívne a gram negatívne, ktoré sú veľmi dôležité pri klasifikácii a identifikácii baktérií. Mikrobiológovia počas štúdií vykonávajú farbenie podľa gramu ako počiatočný krok pri charakterizácii baktérií.
Baktérie sú zoskupené na základe rozdielov v ich bunkovej stene. Gram pozitívne baktérie sa skladajú z hrubej peptidoglykánovej vrstvy v ich bunkovej stene, zatiaľ čo gramnegatívne baktérie sa skladajú z tenkej peptidoglykánovej vrstvy v ich bunkovej stene. Výsledok farbenia podľa gramu bude založený na rozdiele v hrúbke peptidoglykánovej vrstvy bunkovej steny.
Gramsovo farbenie sa vykonáva pomocou štyroch rôznych činidiel, a to; primárne moridlo, moridlo, odfarbovacie činidlo a protimoridlo. Kryštálová violeť a safranín sa používajú ako primárne a protifarbivá, zatiaľ čo gramy jódu a 95% alkoholu sa používajú ako moridlo a odfarbovač. Základné kroky gramového farbenia sú nasledovné;
- Na čistom sklíčku sa pripraví bakteriálny náter, zafixuje sa teplom a ochladí.
- Šmuh je zaplavený kryštálovou fialovou na 1 – 2 minúty.
- Ster sa opláchne pomaly tečúcou vodou z vodovodu, aby sa odstránili prebytočné škvrny.
- Gramy jódu sa nanesú na náter na 1 minútu.
- Ster sa opláchne pomaly tečúcou vodou z vodovodu
- Ster sa premyje 95% alkoholom po dobu 2 – 5 sekúnd a opláchne pomaly tečúcou vodou z vodovodu.
- Ster je zafarbený safranínom počas 1 minúty
- Ster sa opláchne pomaly tečúcou vodou z vodovodu, vysuší sa a pozoruje sa pod mikroskopom.
Na konci gramového farbenia budú gramnegatívne baktérie pozorované ružovou farbou, zatiaľ čo grampozitívne baktérie budú pozorované fialovou farbou.
Obrázok 01: Gram negatívne a grampozitívne baktérie
Výsledok farbenia v gramoch je určený hrúbkou peptidoglykánovej vrstvy v ich bunkovej stene. Počas odfarbovacieho kroku sa primárna škvrna a moridlo ľahko odstránia z gramnegatívnych baktérií a stanú sa bezfarebnými, pretože majú tenkú peptidoglykánovú vrstvu. Primárne sfarbenie je zadržané v grampozitívnych baktériách, pretože majú hrubú peptidoglykánovú vrstvu. Kontraškvrna nebude účinná pre grampozitívne baktérie v dôsledku zadržania primárneho zafarbenia. Grampozitívne baktérie budú teda viditeľné v primárnej farbe škvrny, to znamená vo fialovej farbe. Kontraškvrna zafarbí gramnegatívne baktérie a tie budú viditeľné vo farbe zberu, čo je farba safranínu. Preto je ľahké kategorizovať baktérie do dvoch skupín podľa gramového zafarbenia a je cenné pri bakteriálnej diferenciácii a identifikácii.
Čo je Acid Fast?
Kylostálosť je fyzikálna vlastnosť určitých baktérií, konkrétne ich odolnosť voči odfarbovaniu kyselinami počas farbenia. Po zafarbení tieto organizmy odolávajú postupom odfarbovania na báze zriedenej kyseliny alebo etanolu, ktoré sú bežné v mnohých protokoloch farbenia. Týmto organizmom sa teda dáva názov „kyslý“. Táto vlastnosť sa prejavuje vysokou hladinou voskového materiálu (mykolových kyselín) v ich bunkových stenách. Tento test je rozhodujúci pre identifikáciu Mycobacterium tuberculosis.
Obrázok 2: Acid Fast Mycobacteria
Toto acidorezistentné farbenie vyvinul Paul Ehrlich v roku 1882. Ehrlichovu acidorezistentnú techniku upravil Ziehl-Neelsen a teraz sa používa častejšie. Postup kyslého rýchleho farbenia zahŕňa tri rôzne činidlá. Ako primárne moridlo sa používa karbol fuschin. Ako odfarbovacie činidlo sa používa kyslý alkohol. Ako kontrastné moridlo sa používa metylénová modrá. Postup farbenia sa vykonáva nasledovne.
- Primárne farbenie (karbol fuchsín) sa aplikuje na fixovanú vzorku na sklíčku (všetky bunky budú zafarbené červenou farbou).
- Sklíčko sa zahrieva naparovaním počas 5 minút, čím sa škvrny správne dostanú do buniek.
- Potom sa pridá odfarbovací roztok (Tým sa odstráni červené farbivo zo všetkých buniek okrem kyslých baktérií).
- Metylénová modrá sa pridáva ako kontrastné farbivo (zafarbí všetky odfarbené bakteriálne bunky).
- Kyslé rýchle baktérie zostávajú červené, zatiaľ čo nekyslé rýchle baktérie sa farbia na modro.
Aké sú podobnosti medzi Gramovým farbením a Acid Fast?
- Gramove farbenie a Acid fast sú dve rôzne techniky farbenia.
- Obe techniky kategorizujú baktérie do dvoch skupín.
- Obe techniky používajú dve škvrny a jedno odfarbovanie.
Aký je rozdiel medzi Gramovým farbením a Acid Fast?
Gram Stain vs Acid Fast |
|
| Gram farbenie je technika diferenciálneho farbenia, ktorá rozdeľuje baktérie do dvoch skupín na gram-pozitívne baktérie a gram-negatívne baktérie. | Acid Fast stain je rozdielne farbenie, ktoré sa používa na identifikáciu acidorezistentných organizmov od nekyslených organizmov. |
| Primárna škvrna | |
| Kryštáľová fialová je bežne používané primárne farbenie pri farbení podľa gramov. | Carbol fuchsin je primárna škvrna používaná v kyslom prostredí. |
| Odfarbovacie činidlo | |
| 95% alkohol sa používa ako odfarbovacie činidlo v gramových škvrnách. | Kyslý alkohol sa používa ako odfarbovacie činidlo pri acidorezistencii. |
| Counter Stain | |
| Gramovo farbenie používa ako protifarbivo safranín. | Acid rýchle moridlo používa ako protifarbivo metylénovú modrú. |
| Postreh | |
| Gramnegatívne baktérie sú pozorované vo farbe zberu a grampozitívne baktérie sú pozorované vo fialovej farbe. | Acid Fast baktérie sú pozorované červenou farbou a nekyslé rýchle baktérie sú pozorované modrou farbou. |
Súhrn – Gram Stain vs Acid Fast
Vizualizácia mikroorganizmov v živom stave je náročná. Preto sa na štúdium ich vlastností vo veľkej miere používajú biologické škvrny a postupy farbenia. Diferenciálne farbenie je jedným typom techniky farbenia používanej na odlíšenie baktérií. Gramovo farbenie a acidorezistentné farbenie sú dve rôzne techniky farbenia. Gramové farbenie rozlišuje gramnegatívne baktérie a grampozitívne baktérie na základe hrúbky ich bunkových stien. Kyslé rýchle farbenie odlišuje kyslé rýchle baktérie od nekyslých rýchlych baktérií na základe obsahu kyseliny mykolovej v bunkovej stene. Toto je rozdiel medzi kyselinovou stálosťou a gramovým zafarbením.
Stiahnuť PDF verziu Gram Stain vs Acid Fast
Verziu tohto článku si môžete stiahnuť vo formáte PDF a použiť ju na offline účely podľa citácie. Stiahnite si PDF verziu tu Rozdiel medzi Gramovým škvrnám a Acid Fast.
