Kľúčový rozdiel medzi náhodnými primérmi a oligo dT je v tom, že náhodný primér je zmesou všetkých možných hexamérnych oligonukleotidových sekvencií, zatiaľ čo primér oligo dT pozostáva z jednovláknového úseku 12–18 deoxytymidínov.
Reverzná transkripcia je mechanizmus, v ktorom môže byť cDNA syntetizovaná pomocou mRNA alebo akéhokoľvek druhu RNA. Na produkciu cDNA by sa mal poskytnúť enzým reverznej transkriptázy a ďalšie potrebné zložky, najmä templát a priméry. Priméry sú krátke sekvencie DNA špecificky navrhnuté na amplifikáciu cieľových sekvencií. Náhodné priméry a oligo dT priméry sú dva bežné typy primérov používaných pri reverznej transkripcii. Preto náhodný primér alebo oligo dT primér sú krátke DNA oligonukleotidové sekvencie potrebné pre reverznú transkriptázu na spustenie reverznej transkripcie. V závislosti od RNA templátu možno z týchto dvoch typov primérov vybrať vhodný primér.
Čo sú náhodné primery?
Náhodný primér je zmes oligonukleotidov reprezentujúcich všetky možné hexamérne sekvencie. Sekvencia primérov náhodného priméru je 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T alebo C. Preto je možné náhodné priméry použiť na amplifikáciu jednovláknovej DNA alebo RNA pomocou DNA polymerázy alebo reverznej transkriptázy, resp. Okrem toho je zmes náhodných primérov schopná amplifikovať všetky oblasti RNA za vzniku cDNA. Takto produkuje cDNA rôznej dĺžky.
Obrázok 01: Random Primers
Najdôležitejšie je, že náhodná zmes primérov nevykazuje templátovú špecifickosť. Nie je schopný rozlíšiť mRNA a iné druhy RNA. A žíha s akýmkoľvek druhom RNA vo vzorke. Náhodná zmes primérov je však vhodná na reverznú transkripciu RNA bez poly(A) koncov, ako je rRNA, tRNA, nekódujúce RNA, malé RNA, prokaryotická mRNA atď., degradovaná RNA a RNA so známymi sekundárnymi štruktúrami.
Čo je Oligo dT?
Oligo dT primer je úsek 12 – 18 deoxytymínu (dT). Sekvencia priméru môže byť reprezentovaná ako 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3. Používa sa na produkciu cDNA z mRNA obsahujúcej poly(A) chvost. V podstate pôsobí ako primér pre reakciu katalyzovanú reverznou transkriptázou. Počas reverznej transkripcie sa primér oligo dT aneluje s polyadenylovaným chvostom nachádzajúcim sa na 3' konci väčšiny eukaryotických mRNA a spúšťa proces.
Obrázok 02: Reverzná transkripcia pomocou Oligo dT Primer
Na rozdiel od náhodného priméru nie je primér oligo dT vhodný pre degradovanú RNA alebo RNA, ktorým chýbajú poly(A) konce, vrátane prokaryotickej RNA a mikroRNA.
Aké sú podobnosti medzi náhodnými primermi a Oligo dT?
- Náhodný primér a oligo dT primér sú dva typy primérov, ktoré sa používajú pri reverznej transkripcii a tvorbe cDNA.
- Spoločné použitie náhodného priméru a oligo dT priméru zvyšuje citlivosť syntézy cDNA.
- Sú to jednovláknové krátke nukleotidové sekvencie.
Aký je rozdiel medzi náhodnými primermi a Oligo dT?
Náhodný primér je krátka oligonukleotidová sekvencia zložená z náhodnej sekvencie. Primér oligo dT je krátky reťazec zložený z 12 až 18 deoxytymidínov. Toto je kľúčový rozdiel medzi náhodnými primérmi a oligo dT. Sekvencia náhodného priméru je 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T alebo C. Zatiaľ čo sekvencia oligo dT priméru je 5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´. Preto to môžeme považovať za ďalší rozdiel medzi náhodnými primérmi a oligo dT.
Okrem toho náhodné priméry nevykazujú templátovú špecifickosť a anelujú s akýmkoľvek druhom RNA, zatiaľ čo oligo dT priméry vykazujú špecifickosť pre poly(A) konce eukaryotickej mRNA.
Nasledujúca infografika sumarizuje rozdiel medzi náhodnými primérmi a oligo dT.
Súhrn – Random Primers vs Oligo dT
Náhodný primér a oligo dT primér sú dva typy primérov používaných pri syntéze cDNA. Náhodný primér pozostáva zo zmesi oligonukleotidov, ktoré predstavujú všetky možné hexamérne sekvencie, zatiaľ čo primér oligo dT je jednovláknová sekvencia 12 až 18 deoxytymidínov. Toto je kľúčový rozdiel medzi náhodnými primérmi a oligo dT. Okrem toho sú oligo dT priméry užitočné na reverznú transkripciu RNA s plnou dĺžkou s poly(A) chvostom, zatiaľ čo náhodné priméry sú užitočné na reverznú transkripciu väčšiny druhov RNA, vrátane degradovanej RNA, RNA, ktorá nemá poly(A) konce a RNA obsahujúcej sekundárne štruktúry. Preto náhodný primér nevykazuje templátovú špecifickosť, zatiaľ čo oligo dT primér vykazuje špecifickosť voči eukaryotickej mRNA obsahujúcej poly(A) koniec.
