Kľúčový rozdiel medzi chromatofokáciou a izoelektrickou fokusáciou je v tom, že chromatofokusácia je typ stĺpcovej chromatografickej metódy, ktorá využíva iónomeničové živice, zatiaľ čo izoelektrická fokusácia je typ elektroforéznej techniky, ktorá využíva imobilizované gély s gradientom pH.
Chromatofokusácia a izoelektrická fokusácia sú dve techniky, ktoré oddeľujú proteíny podľa ich izoelektrických bodov. Chromatofokusovanie aj izoelektrické zaostrovanie majú veľkú rozlišovaciu schopnosť. Chromatofocusing je metóda stĺpcovej chromatografie s vysokým rozlíšením, zatiaľ čo izoelektrická fokusácia je elektroforetická separačná metóda. Navyše, chromatofokusovanie nepoužíva elektrické pole, zatiaľ čo izoelektrické zaostrovanie potrebuje elektrické pole.
Čo je chromatofocusing?
Chromatofocusing je typ vysokoelučnej chromatografie, ktorá oddeľuje proteíny podľa rozdielov v ich izoelektrickom bode. Používa iónomeničovú živicovú kolónu a interne vyvinutý gradient pH. Na rozdiel od izoelektrického zaostrovania nezahŕňa chromatofokusovanie elektrické pole. Chromatofocusing je výkonná purifikačná technika, ktorá dokáže rozlíšiť veľmi podobné molekuly, ktoré sa dokonca líšia len o 0,02 jednotiek pH. Preto je chromatofokusácia najvhodnejšia ako konečný krok leštenia, keď sa vyžaduje vysoké rozlíšenie pri oddeľovaní veľmi podobných komponentov.
Pri chromatofokusácii sa vzorka aplikuje na kolónu zmiešaním so štartovacím pufrom. Proteíny, ktoré sú pri pH nad svojim izoelektrickým bodom, sú negatívne nabité a zostávajú blízko vrcholu kolóny, zatiaľ čo iné proteíny, ktoré majú pH pod svojím izoelektrickým bodom, migrujú po kolóne. Proteín s najvyšším izoelektrickým bodom sa eluuje ako prvý, zatiaľ čo proteín s najnižším izoelektrickým bodom sa eluuje z kolóny ako posledný. Táto technika je ovplyvnená niekoľkými faktormi, ako je zrážanie proteínov a linearita gradientu pH.
Čo je izoelektrické zaostrovanie?
Izoelektrické zaostrovanie je technika, ktorá oddeľuje rôzne molekuly na základe ich izoelektrického bodu. Je tiež známy ako elektrofocusing. Táto technika sa často používa na separáciu proteínov v géli. Pri izoelektrickej fokusácii sa vzorka pridá do gélov s imobilizovaným pH gradientom (IPG). IPG gél je matrica akrylamidového gélu kopolymerizovaná s gradientom pH. Proteíny migrujú smerom ku katóde, kým nenájdu oblasť pH svojich izoelektrických bodov. Keď proteín dosiahne pH, ktoré nemá žiadny čistý náboj, migrácia sa zastaví a vytvorí sa stacionárny pás. Podobne každý proteín vytvára pás v bode gradientu pH, ktorý zodpovedá jeho izoelektrickému bodu.
Obrázok 01: Izoelektrické zaostrovanie
Izoelektrické zaostrovanie je prvým krokom dvojrozmernej gélovej elektroforézy. Pri tejto technike sa proteíny najprv separujú podľa ich izoelektrických bodov izoelektrickou fokusáciou a potom sa separujú podľa ich molekulovej hmotnosti pomocou SDS-PAGE.
Aké sú podobnosti medzi chromatofókusovaním a izoelektrickým zaostrovaním?
- Chromatofokusácia a izoelektrické zaostrovanie sú dve metódy s vysokým rozlíšením.
- Obe sú založené na izoelektrickom bode bielkovín.
- Tieto techniky využívajú gradient pH.
- Oba postupy sú informatívne pre charakterizáciu variantov ľudského hemoglobínu.
- Dokážu rozlíšiť molekuly, kde sa hodnoty pI líšia len o 0,02 jednotiek pH.
Aký je rozdiel medzi chromatofókusovaním a izoelektrickým zaostrovaním?
Chromatofocusing je technika stĺpcovej chromatografie s vysokým rozlíšením, ktorá oddeľuje proteíny podľa ich izoelektrického bodu. Na rozdiel od toho je izoelektrická fokusácia elektroforetická technika, ktorá oddeľuje proteíny podľa ich izoelektrického bodu aplikáciou elektrického poľa pozdĺž gradientu pH vytvoreného v kapiláre. Toto je kľúčový rozdiel medzi chromatofokusovaním a izoelektrickým zaostrovaním.
Ďalším rozdielom medzi chromatofokáciou a izoelektrickou fokusáciou je, že chromatofokusácia nezahŕňa elektrické pole, zatiaľ čo izoelektrická fokusácia potrebuje elektrické pole.
Zhrnutie – Chromatofocusing verzus izoelektrické zaostrovanie
Chromatofokusácia a izoelektrická fokusácia sú dve podobné techniky, ktoré majú vysokú rozlišovaciu schopnosť molekúl, najmä veľmi podobných molekúl. Chromatofocusing je technika stĺpcovej chromatografie s vysokým rozlíšením, zatiaľ čo izoelektrická fokusácia je metóda elektroforézy. Chromatofocusing nezahŕňa elektrické pole, na rozdiel od izoelektrického zaostrovania. Toto sumarizuje rozdiel medzi chromatofokusovaním a izoelektrickým zaostrovaním.
