Kľúčový rozdiel medzi Golden Gate a Gibson Assembly je ten, že Golden Gate sa spolieha na prítomnosť reštrikčných miest v rámci konkrétnej sekvencie, ktorá sa má klonovať, zatiaľ čo Gibson Assembly sa nespolieha na prítomnosť reštrikčných miest v rámci konkrétnej sekvencie, aby byť klonovaný.
V priebehu posledných desaťročí vyvinuli molekulárni vedci rôzne štandardizované postupy, ktoré umožňujú jednoduchšie zostavenie viacerých fragmentov DNA do jedného kusa. Preto metódy klonovania, ako je ligácia reštrikčného enzýmu, klonovanie brány, zostava Gibson, zostava Golden Gate a klonovanie TOPO, sú široko používané výskumníkmi vo vedeckých experimentoch. Preto sú Golden Gate a Gibson Assembly dve metódy molekulárneho klonovania, ktoré umožňujú zostavenie viacerých fragmentov DNA do jedného kusu.
Čo je to zhromaždenie Golden Gate?
Golden Gate je metóda molekulárneho klonovania, ktorá uľahčuje zostavenie viacerých fragmentov DNA do jedného kusu. Táto metóda sa spolieha na prítomnosť reštrikčných miest v konkrétnej sekvencii, ktorá sa má klonovať. Vznikla v roku 1996. Táto technika využíva reštrikčné enzýmy typu IIS a T4 DNA ligázu. Tieto enzýmy štiepia DNA mimo rozpoznávacích miest. Môžu vytvárať nepalindromické previsy. Preto je možné zostaviť viacero fragmentov DNA pomocou kombinácií presahujúcich sekvencií.
Obrázok 01: Golden Gate
Postup montáže zlatej brány
Technika Golden Gate má vo svojom postupe tri hlavné kroky:
- vytvorenie previsov v klonovacom vektore,
- zostavenie viacerých DNA inzertov pomocou fragmentovo špecifických sekvencií v previsoch a
- ligácia.
Zostava Golden Gate využíva kruhové klonovacie vektory (vektor cieľa). Okrem toho sa v tomto spôsobe reštrikčné miesto odstráni z ligovaného produktu, aby sa uskutočnilo štiepenie a ligácia súčasne. Typický protokol tepelného cyklu pre Golden Gate osciluje medzi 37 °C a 16 °C, pretože 37 °C je optimálnych pre reštrikčné enzýmy a 16 °C je optimálnych pre ligázy.
Čo je Gibson Assembly?
Gibson Assembly je metóda molekulárneho klonovania, ktorá umožňuje zostavenie viacerých fragmentov DNA do jedného kusu. Na rozdiel od metódy Golden Gate sa táto metóda nespolieha na prítomnosť reštrikčných miest v konkrétnej sekvencii, ktorá sa má klonovať. Našiel ho Daniel G. Gibson z Inštitútu J. Craiga Ventera. Táto technika je typom metódy klonovania nezávislého od sekvencie a ligázy (SLIC).
Obrázok 02: Zostava Gibson
Postup montáže Gibson
Gibson Assembly potrebuje fragmenty DNA obsahujúce 20-40 párov báz prekrývajúcich sa so susednými fragmentmi DNA. Presahy sa pridávajú pomocou PCR. Potom sa tieto fragmenty DNA pridajú do zmesi Gibson maser, ktorá má tri enzýmy. Tento postup sa uskutočňuje za izotermických podmienok (50 °C počas 1 hodiny) s použitím troch rôznych enzýmov: exonukleázy, DNA polymerázy a DNA ligázy. Exonukleáza prežúva DNA z 5' konca. Neinhibuje teda aktivitu polymerázy a umožňuje, aby reakcia prebiehala v jedinom procese. Výsledné jednovláknové oblasti na susedných fragmentoch DNA môžu byť spojené v dôsledku prekrývajúcich sa sekvencií. DNA polymeráza vypĺňa medzery pridaním nukleotidov. Nakoniec DNA ligáza kovalentne spája DNA susedných segmentov. Za normálnych okolností Gibson Assembly používa linearizované cieľové vektory. Navyše táto metóda môže súčasne kombinovať až 15 fragmentov DNA na základe podobnosti sekvencií.
Podobnosti medzi Golden Gate a Gibson Assembly
- Golden Gate a Gibson Assembly sú dve metódy molekulárneho klonovania.
- Obe metódy dokážu zostaviť viacero fragmentov DNA do jedného kusu.
- Tieto metódy používajú cieľové vektory.
- Obe metódy využívajú tepelné cykléry na zostavenie viacerých fragmentov DNA.
- Používajú sa pri miestne riadenej mutagenéze.
Rozdiel medzi Golden Gate a Gibson Assembly
Golden Gate je metóda molekulárneho klonovania používaná pri zostavovaní viacerých fragmentov DNA do jedného kusa, pričom sa spolieha na prítomnosť reštrikčných miest v rámci konkrétnej sekvencie, ktorá sa má klonovať, zatiaľ čo Gibson Assembly je metóda molekulárneho klonovania používaná v zostavenie viacerých fragmentov DNA do jedného kusu bez spoliehania sa na prítomnosť reštrikčných miest v konkrétnej sekvencii, ktorá sa má klonovať. Toto je kľúčový rozdiel medzi Golden Gate a Gibson Assembly. Okrem toho metóda Golden Gate používa kruhový cieľový vektor, zatiaľ čo metóda Gibson Assembly používa linearizovaný vektor cieľov.
Nasledujúca infografika znázorňuje rozdiel medzi Golden Gate a Gibson Assembly.
Zhrnutie – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekulárne klonovanie je metóda používaná na zostavenie molekúl rekombinantnej DNA a riadenie ich replikácie v hostiteľských organizmoch. Golden Gate a Gibson Assembly sú dve metódy molekulárneho klonovania, ktoré umožňujú zostavenie viacerých fragmentov DNA do jedného kusu. Metóda Golden Gate sa spolieha na prítomnosť reštrikčných miest v konkrétnej sekvencii, ktorá sa má klonovať, zatiaľ čo Gibson Assembly sa nespolieha na prítomnosť reštrikčných miest v konkrétnej sekvencii, ktorá sa má klonovať. Toto je kľúčový rozdiel medzi Golden Gate a Gibson Assembly.
