Kľúčový rozdiel – teplá a studená trypsinizácia
Teplá a studená trypsinizácia sú dve metódy používané pri enzymatickej disagregácii buniek pri kultivácii živočíšnych buniek. Kľúčový rozdiel medzi teplou a studenou trypsinizáciou, ako naznačujú názvy, závisí od teploty, pri ktorej sa trypsín pridáva na bunkovú disagregáciu. Teplá trypsinizácia prebieha za vyšších teplotných podmienok (36,5 – 37 0C), zatiaľ čo studená trypsinizácia prebieha za podmienok nízkej teploty.
Počas procesu primárnej bunkovej kultivácie živočíšnych buniek sa používajú tri hlavné metódy, ktoré sa ukázali ako úspešné. Tieto tri metódy zahŕňajú mechanickú disagregáciu buniek, enzymatickú disagregáciu buniek a techniku primárneho explantátu. Enzymatická disagregácia buniek, ktorá vedie k izolácii buniek, sa uskutočňuje enzýmom degradujúcim proteín trypsín. Preto je tento proces známy ako trypsinizácia. Trypsinizácia sa môže uskutočňovať za dvoch rôznych podmienok, a to teplej trypsinizácie a studenej trypsinizácie. Teplá trypsinizácia je metóda ošetrenia buniek trypsínom za teplých podmienok pri teplote 36,5 – 37 0C. Trypsinizácia za studena je proces úpravy trypsínom, ktorý prebieha za chladnejších podmienok, najlepšie na ľade s veľmi nízkymi teplotami.
Čo je teplá trypsinizácia?
Trypsinizácia sa môže vykonať na disagregáciu bunkových zložiek, aby sa bunky izolovali a vytvorili sa tak primárna bunková kultúra. Trypsín je enzým degradujúci proteín a zmes enzýmov používaná pri trypsinizácii môže byť buď surový extrakt alebo purifikovaný produkt. O surovom extrakte sa hovorí, že je účinnejší pri lýze proteínov a dezintegrácii buniek, pretože obsahuje ďalšie degradačné enzýmy.
Teplá trypsinizácia je najbežnejšie používaná enzymatická metóda na bunkovú disagregáciu, ktorá prebieha pri vyšších teplotách. Pred ošetrením trypsinizáciou sa požadované tkanivo naseká na menšie kúsky. Uľahčuje proces ľahkej dezagregácie. Nasekané tkanivo sa potom premyje v špeciálnom médiu známom ako médium Dissection Basal S alt.
Po dokončení premývacieho kroku sa bunky transformujú do banky obsahujúcej aktívny enzým, ktorým je trypsín. Keďže táto technika zahŕňa protokol teplej trypsinizácie, trypsín sa umiestni pri teplote okolo 37 0C na približne štyri hodiny.
Obrázok 01: Trypsín
Obsah sa mieša a premiešava pomocou centrifugačných metód, aby sa zjednodušil protokol a urýchlil proces dezagregácie. Po dosiahnutí odporúčaného času sa bunky môžu získať zo supernatantu. Bunky odvodené zo supernatantu sa potom inkubujú pri určitej teplote a čase.
Čo je studená trypsinizácia?
Studená trypsinizácia je ďalší typ trypsinizácie, ktorý prebieha v chladných podmienkach. Pri tejto technike sa bunky, ktoré sú nasekané a premyté, umiestnia do fľaštičiek na ľade a potom sa namočia trypsínom. Doba namáčania je oveľa dlhšia – asi 6 – 24 hodín.
Po dokončení postupu namáčania sa trypsín odstráni z bunkového lyzátu a kúsky tkaniva sa ďalej inkubujú pri teplote 37 0C približne 20 – 30 minút. Desagregácia buniek sa dosiahne opakovaným pipetovaním tkanivovej zmesi. To umožní bunkám disociovať sa z membrány a dostať sa do supernatantu. Akonáhle sú bunky v supernatante, sú inkubované a pestované pri požadovanej teplote a časovom období.
Metóda trypsinizácie za studena má niekoľko výhod
- Vyššia výťažnosť životaschopných buniek, pretože poškodenie buniek je minimalizované. Poškodenie buniek sa minimalizuje nepoužívaním krokov odstreďovania.
- Veľmi pohodlný spôsob.
- Menej pracné.
Hlavným obmedzením metódy studenej trypsinizácie je, že nemožno použiť veľké množstvá v jednom prípade.
Aké sú podobnosti medzi teplou a studenou trypsinizáciou?
- Procesy teplej aj studenej trypsinizácie využívajú enzým trypsín na disagregáciu buniek.
- Pri postupoch bunkovej kultúry na disagregáciu buniek sa používajú teplé aj studené trypsinizačné procesy.
- Pri teplom aj studenej trypsinizácii sú bunky získané zo supernatantu.
Aký je rozdiel medzi teplou a studenou trypsinizáciou?
Teplá vs studená trypsinizácia |
|
| Teplá trypsinizácia je metóda ošetrenia buniek trypsínom za teplých podmienok pri teplote 36,5 – 37 0. | Studená trypsinizácia je proces úpravy trypsínom, ktorý prebieha v chladnejších podmienkach, najlepšie na ľade, pri udržiavaní veľmi nízkych teplôt. |
| Protokol | |
| Nasekané kúsky tkaniva sa udržiavajú pri teplote 37 0C nepretržite počas celého postupu. | Nasekané kúsky tkaniva sa najprv udržiavajú pri ľadovo studenej teplote a potom sa udržiavajú pri teplote 37 0. |
| Teplota | |
| Teplá trypsinizácia nastáva pri 36,5 – 37 0 | Studená trypsinizácia prebieha pri ľadových teplotách. |
| Spotrebovaný čas | |
| Na celý proces teplej trypsinizácie je potrebný kratší čas (približne 4 hodiny). | Na studenú trypsinizáciu je potrebný dlhší čas (približne 6 – 24 hodín). |
| Výťažok životaschopných buniek | |
| Nízka teplá trypsinizácia. | Vysoká trypsinizácia za studena. |
| Použitie odstreďovania | |
| Centrifugácia je potrebná na disagregáciu buniek pri teplej trypsinizácii. | Pri studenej trypsinizácii nie je potrebná centrifugácia. |
| Počiatočné množstvo tkaniva na trypsinizáciu | |
| Pri teplej trypsinizácii možno použiť väčšie množstvo tkaniva. | Pri studenej trypsinizácii možno použiť menšie množstvo tkaniva. |
| Poškodenie buniek | |
| Vysoké v dôsledku odstreďovania pri teplej trypsinizácii. | Menej v dôsledku studenej trypsinizácie. |
Zhrnutie – Teplá verzus studená trypsinizácia
Trypsinizácia je metóda využívajúca enzým trypsín degradujúci proteíny na disagregáciu a prípravu primárnych bunkových kultúr počas procesu kultivácie buniek. Existujú dve hlavné techniky trypsinizácie založené na teplotách použitých počas postupu. Sú to teplá a studená trypsinizácia. Teplá trypsinizácia sa uskutočňuje pri 37 0C, zatiaľ čo studená trypsinizácia sa uskutočňuje v ľadovo studených podmienkach. Hoci studená trypsinizácia trvá dlhší čas na dokončenie, hovorí sa, že má vyšší výťažok životaschopných buniek. Je to spôsobené skutočnosťou, že poškodenie buniek je minimalizované pri studenej trypsinizácii, pretože sa nepoužívajú intenzívne kroky odstreďovania. Toto je rozdiel medzi teplou a studenou trypsinizáciou.
