Kľúčový rozdiel medzi Klenowovou a T4 DNA polymerázou je v tom, že Klenowov fragment je veľký fragment E. coli DNA polymerázy 1, zatiaľ čo T4 DNA polymeráza je DNA polymeráza 1 bakteriofága T4.
DNA polymerázy sú enzýmy, ktoré katalyzujú tvorbu DNA pridaním deoxyribonukleotidov na 3′-OH koniec už existujúceho priméru. Existujú rôzne typy DNA polymeráz. Väčšina DNA polymeráz používaných v molekulárnej biológii sú prokaryotické DNA polymerázy. Klenowov fragment a T4 DNA polymeráza sú dva typy DNA polymeráz, ktoré majú prokaryotický pôvod. Klenowov fragment je veľký fragment, ktorý vzniká štiepením E.coli DNA polymeráza 1 na dva fragmenty bakteriálnou proteázou subtilizín. T4 DNA polymeráza je DNA polymeráza 1 bakteriofága T4. Klenow aj T4 DNA polymeráza majú 5′→3′ polymerázovú a 3′→5′ exonukleázovú aktivitu. Obom im chýba 5′→3′ exonukleázová aktivita, vďaka čomu sú vhodnejšie pre mnohé aplikácie v molekulárnej biológii.
Čo je Klenow?
Klenowov fragment je DNA polymeráza, ktorá je užitočná v molekulárnej biológii. Keď E. coli DNA polymeráza 1 podlieha proteolytickému štiepeniu bakteriálnou proteázou, subtilizínom, výsledkom sú dva fragmenty: jeden je veľký fragment a druhý je malý fragment. Klenowov fragment je veľký fragment, ktorý má veľkosť 68 kDa. Klenowov fragment má 5′→3′ polymerázovú a 3′→5′ exonukleázovú (korektúru) DNA Pol I. 3′→5′ exonukleázová aktivita Klenowovho fragmentu uľahčuje odstránenie nesprávne pridaných báz pri postupujúcej polymerizácii. Klenow fragment neobsahuje 5′→3′ exonukleázovú aktivitu, ktorá je znázornená v plnej dĺžke alebo intaktnou E.coli DNA polymeráza 1. Je výhodné, keď je potrebná len samotná polymerizačná aktivita. Klenowove fragmenty sa používajú na vyplnenie 5' previsov, syntézu sond, sekvenovanie DNA, syntézu dvojvláknovej DNA, syntézu druhého vlákna cDNA a miestne cielenú mutagenézu.
Obrázok 01: Klenowov fragment
V určitých aplikáciách sa 3′→5′ exonukleázová aktivita Klenowovho fragmentu tiež stáva nežiaducou. Môže sa odstrániť zavedením mutácie do génu, ktorý kóduje Klenowov fragment. Výsledný Klenow fragment je známy ako exo-Klenow fragment. Exo-Klenow fragment má teda len 5′→3′ polymerázovú aktivitu E. coli polymerázy 1.
Čo je T4 DNA polymeráza?
T4 DNA polymeráza je DNA polymeráza, ktorá katalyzuje syntézu DNA. Je to proteín kódovaný bakteriofágom T4. Štrukturálne je T4 DNA polymeráza proteín s 898 aminokyselinovými zvyškami (molekulová hmotnosť 103,6 kDa). Vyžaduje templát a primer na katalyzovanie syntézy.
Obrázok 02: T4 DNA polymeráza
Podobne ako Klenowov fragment, T4 DNA polymeráza má 5′→3′ polymerázové aj 3′→5′ exonukleázové aktivity. Navyše mu chýba aj 5′→3′ exonukleázová aktivita. T4 DNA polymeráza je užitočná pri vypĺňaní 5'-vyčnievajúcich koncov DNA fragmentov. Často sa tiež používa na 5'-koncové alebo 3'-koncové značenie dvojvláknovej DNA. T4 DNA polymeráza sa často používa pri tupom klonovaní. 3′→5′ exonukleázová (korekčná) aktivita T4 DNA polymerázy je silnejšia (viac ako 200-krát) ako Klenowov fragment. Najdôležitejšie je, že T4 DNA polymeráza má vysokú spracovateľnosť (400 nukleotidov za sekundu).
Aké sú podobnosti medzi Klenowovou a T4 DNA polymerázou?
- Klenow a T4 DNA polymeráza sú dve prokaryotické polymerázy.
- Obe polymerázy majú 5′→3′ polymerázovú a 3′→5′ exonukleázovú aktivitu.
- Nevykazujú 5′→3′ exonukleázovú aktivitu.
- Oba enzýmy vyžadujú templát a primer na katalyzovanie syntézy DNA.
- Tieto enzýmy možno tepelne inaktivovať pri 75 0
Aký je rozdiel medzi Klenowovou a T4 DNA polymerázou?
Kľúčovým rozdielom medzi Klenowovou a T4 DNA polymerázou je pôvod každého enzýmu. Klenow fragment pochádza z baktérie, zatiaľ čo T4 DNA polymeráza pochádza z bakteriofága, ktorý je vírusom. T4 DNA polymeráza má vyššiu procesivitu ako Klenowov fragment. Okrem toho má T4 DNA polymeráza silnú korekčnú aktivitu ako Klenowov fragment. Toto je ďalší rozdiel medzi Klenowovou a T4 DNA polymerázou.
Informačná grafika uvedená nižšie uvádza ďalšie rozdiely medzi Klenowovou a T4 DNA polymerázou v tabuľkovej forme.
Zhrnutie – Klenow vs T4 DNA polymeráza
Klenowov fragment je veľký fragment E. coli DNA polymerázy 1. Má len 5′→3′ polymerázovú a 3′→5′ exonukleázovú aktivitu. Chýba mu 5′→3′ exonukleázová aktivita intaktnej E. coli DNA pol 1. Klenowov fragment je preto bakteriálna polymeráza. Na druhej strane T4 DNA polymeráza je polymeráza kódovaná bakteriofágom T4. Podobne ako Klenowov fragment obsahuje 5′→3′ polymerázové aj 3′→5′ exonukleázové aktivity a chýba mu 5′→3′ exonukleázová aktivita. Avšak T4 DNA polymeráza má vysokú spracovateľnosť a vysokú korektúrnu aktivitu ako Klenowov fragment. Toto je kľúčový rozdiel medzi Klenowovou a T4 DNA polymerázou.
